cr基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收-文庫(kù)吧
2025-04-25 00:12 本頁(yè)面
【正文】 l也能激活 Taq DNA聚合酶的活性 。 Taq DNA聚合酶被蛋白酶 K降解 無(wú) 3’ ? 5’DNA 外切酶活性，但高溫下能 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA，又能擴(kuò)增 DNA 有 3‘?5’外切酶活性， 能耐受 100oC高溫 。 其它耐熱的 DNA聚合酶 ?Tth DNA聚合酶： ?Vent DNA聚合酶： ?Pfu DNA聚合酶： 有 3‘?5’外切酶活性， 是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫 DNA 聚合酶中出錯(cuò)率最低的 ?Taq Plus DNA聚合酶： Taq和 Pfu DNA聚合酶的混合物 Taq的 PCR產(chǎn)物 3’端往往帶有一個(gè) A 基因工程原理（吳乃虎） 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版） 2. 引物設(shè)計(jì)的總原則： 擴(kuò)增的效率和特異性 5’ 端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè) 內(nèi)切酶的切點(diǎn) 順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。 3’ 端必須與模板正確配對(duì)， 5’ 端可以不配對(duì) 5’ATGACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ template primer 引物的堿基序列：一般長(zhǎng) 15— 30bp 盡可能提高 G+C含量 ，以提高引物與模板的結(jié)合力 避免 連續(xù)相同堿基 排列或內(nèi)部 回文序列 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC 3’ CTGCCAGTCTAC 3’ GACGG 5’ T 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物的堿基組成： 引物內(nèi)部不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)： 盡可能隨機(jī)分布， G+C含量 4555%。 兩個(gè)引物間不能有兩個(gè)以上連續(xù)堿基互補(bǔ)序列 避免形成引物二聚體（ dimer） 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用 專業(yè)軟件 如 ， DNA database等 Tm=（ G+C)?4 + (A+T)?2 Tm= +(lg[K+])+(%[G+C])675/n 適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。 一般估計(jì)：當(dāng)引物中的（ G+C）含量低于 50%時(shí)，復(fù)性溫度低于 55℃ 。 引物的 Tm值 : 實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于 Tm值 5℃ 引物的濃度 : 一般使用終濃度各 ?mol/L 模板的量： 不能太多 ， 100?l反應(yīng)體系中約 100ng 純度： PCR對(duì)模板 DNA的純度要求不高，但不能有蛋白質(zhì)變性劑、 DNA酶、 Mg2+的螯合劑 等影響 DNA聚合酶的活性。 3. 模板（ template) dNTPs 是 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP的總稱，一般反應(yīng)體系中 dNTP混合液終濃度用 ，濃度過(guò)高會(huì)抑制 Taq DNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率 4. dNTPs Taq DNA聚合酶要求有游離的 Mg2+ 。所以 Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）， 一般用 。 5. Mg2+ 的濃度 PCR反應(yīng)的條件優(yōu)化 變性溫度和時(shí)間： 9295℃ ，富含 G和 C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失； 退火溫度與時(shí)間： 引物中 G、 C含量高、 長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高，通常 3755℃ 、 12分鐘； 延伸溫度和時(shí)間： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ ；延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間； 循環(huán)次數(shù)： 循環(huán)過(guò)多，非特異性產(chǎn)物大量增加 關(guān)于本次實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌 K12堿性磷酸酶基因序列（ CDS， ） 551 aagttgtcac ggccgagact tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt 601 atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca aagcactatt gcactggcac 651 tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcccggac accagaaatg 701 cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagggc gatattactg cacccggcgg 751 tgctcgccgt ttaacgggtg atcagactgc cgctctgcgt gattctctta 801 gcgataaacc tgcaaaaaat attattttgc tgattggcga tgggatgggg 851 gactcggaaa ttactgccgc acgtaat
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