cr基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收-預(yù)覽頁
【正文】 － PCR ?概述 ?PCR技術(shù)原理 ?PCR特點(diǎn) ?影響因素與條件優(yōu)化 ?關(guān)于本次實(shí)驗(yàn) PCR（ Polymerase Chain Reaction）在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。 ② 高溫下進(jìn)行延伸 敏感性高 : 理論上只要一條模板鏈， 32次循環(huán)就可合成約 109條！ 快 速 :整個(gè) PCR過程約 2～ 4小時(shí) 簡(jiǎn) 便 :對(duì)模板的純度要求低 模板種類多樣化 PCR反應(yīng)的影響因素 Taq DNA 聚合酶 引物 模板 dNTP Mg2+ 1. Taq DNA聚合酶 熱穩(wěn)定性，耐高溫 最適溫度： 7580℃ 延伸速度： 2021bp/min 最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度： 沒有 3’ ?5’ 外切酶活性 合成超過 600bp長(zhǎng)度的 DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配 T aquaticus Taq DNA聚合酶金屬離子敏感（尤其是 Mg2+ ）， 當(dāng) dNTP（能結(jié)合 Mg2+）為 ， MgCl2最佳濃度應(yīng)是 。 3’ 端必須與模板正確配對(duì)， 5’ 端可以不配對(duì) 5’ATGACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ template primer 引物的堿基序列：一般長(zhǎng) 15— 30bp 盡可能提高 G+C含量 ，以提高引物與模板的結(jié)合力 避免 連續(xù)相同堿基 排列或內(nèi)部 回文序列 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC 3’ CTGCCAGTCTAC 3’ GACGG 5’ T 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物的堿基組成： 引物內(nèi)部不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)： 盡可能隨機(jī)分布， G+C含量 4555%。 3. 模板（ template) dNTPs 是 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP的總稱，一般反應(yīng)體系中 dNTP混合液終濃度用 ，濃度過高會(huì)抑制 Taq DNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率 4. dNTPs Taq DNA聚合酶要求有游離的 Mg2+ 。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高，通常 3755℃ 、 12分鐘； 延伸溫度和時(shí)間： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ ；延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。 空隙小，分辨率高：小分子較易通過，大分子難通過 空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。 熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與 DNA含量及大小成正比。重復(fù)一次。合并回收液。 配試劑 第五組配制 第四組配制 第三組配制 ： 1mL、 200uL、 10uL各一盒 5ml 2個(gè) 2. EP管： ， 40個(gè) , 10個(gè) 3. 前述各試劑 工程菌的接種與培養(yǎng) 下周三下午？？？ 滅菌 工程菌的接種與培養(yǎng) 下周三下午？？？ 本周值日：第二組 天冷別忘加衣裳 PCR引物設(shè)計(jì)范例 引物 1 5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’ CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT… …………………………………………………………………………. …… ………………………………… AKP CDS …………………………………. ………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………. CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAA TAAAACCGCGCCCGG3’ 引物 2 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’ BamH1 HindⅢ pETBlue2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT 引物 1： 5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’ BamHⅠ 引物 2： 5’GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3’ HindⅢ
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