多重不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增介紹-文庫(kù)吧
2025-04-25 01:38 本頁(yè)面
【正文】 ? 難點(diǎn)主要體現(xiàn)在前期引物設(shè)計(jì)過(guò)程中 —— 反應(yīng)體系的平衡 反應(yīng)體系不平衡 ? 反應(yīng)體系的 不平衡導(dǎo)致 在前期的幾輪反應(yīng)中某些優(yōu)勢(shì)引物及其模板迅速擴(kuò)增，獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，而這些擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)又是 DNA聚合酶的良好抑制劑（ SantaLucia, 2021）。所以，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的大量出現(xiàn)，聚合酶的聚合能力被越來(lái)越強(qiáng)烈的抑制住了，因此，前期處于劣勢(shì)的引物及其模板，這時(shí)就更加 舉步維艱， 最終導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量非常之小，以至于無(wú)法檢測(cè)。正所謂 強(qiáng)者更強(qiáng)、弱者更弱 。 ? 導(dǎo)致不平衡的原因： 引物特異性； 最佳退火溫度不一致； 引物二聚體； 模板量不同； 引物擴(kuò)增效率 引物特異性 ? 如果引物與體系中其他非目的基因片段結(jié)合能力更強(qiáng)，那么目的基因結(jié)合引物的能力就會(huì)受到競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降。 ? 嚴(yán)格 blast驗(yàn)證 最佳退火溫度不一致 ? 將多對(duì)引物放臵入一個(gè)體系中擴(kuò)增，由于進(jìn)行PCR反應(yīng)的退火溫度相同，所以要求每一對(duì)引物的最佳退火溫度接近。 ? 前期引物設(shè)計(jì)時(shí)減少最佳退火溫度的差異，最佳退火溫度的差異不超過(guò) 3~5176。 為宜。 引物二聚體
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