羅氏實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀-文庫(kù)吧
2025-04-23 06:31 本頁(yè)面
【正文】 擇性地與雙鏈 DNA結(jié)合，在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。在 PCR過(guò)程中， SYBR Green I可與新合成地雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生地?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA含量成正比，熒光檢測(cè)在每一循環(huán)的延期后進(jìn)行。 SYBR Green I與非特異性雙鏈 DNA（如引物二聚體）結(jié)合產(chǎn)生的干擾可通過(guò)融解曲線分析而得到解決。 水解探針（ Taqman ）檢測(cè)模式 同時(shí)標(biāo)記有熒光發(fā)光分子和熒光淬滅分子的一條探針在激發(fā)光作用下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光可被淬滅分子吸收，因而檢測(cè)不到熒光。在 PCR延伸時(shí)，因Taq酶具有的 5， － 3， 核酸外切酶活性，可降解熒光探針，使熒光發(fā)光分子與熒光淬滅分子分開(kāi)，在外界光源激發(fā)下即可發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量有關(guān)。 分子信標(biāo)（ Molecular Beacon Probe） 獨(dú)特的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，由非特異的頸和特異的環(huán)組成，探針的 5’端標(biāo)記熒光分子， 3’端 標(biāo)記一個(gè)吸收或淬滅熒光的分子 。自身環(huán)化時(shí)儀器檢測(cè)不到熒光，在 PCR反應(yīng)的退火階段，探針因與模板鏈雜交而打開(kāi)，使 5’端熒光分子與 3’端吸收或淬滅熒光的分子分開(kāi)，儀器就會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。每一個(gè)循環(huán)，隨著 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)，從而根據(jù)熒光信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)計(jì)算 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。 雜交探針（ HybProbe）檢測(cè)模式 設(shè)計(jì)與檢測(cè)區(qū)互補(bǔ)的分別帶有不同染料標(biāo)記的一對(duì)寡核苷酸（既雜交探針），在與擴(kuò)增的 DNA片斷雜交時(shí)，兩種染料互相接近。其中供體熒光染料受外來(lái)光源激發(fā)后，將能量傳遞給附近的受體染料，既發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET），從而釋放出受體染料分子的發(fā)射波長(zhǎng)熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度和 DNA的產(chǎn)量成正比。其他非特異性產(chǎn)物由于不會(huì)與探針雜交，因而不產(chǎn)生信號(hào)干擾。 Annealing Elongation End of Elongation Denaturation Fluorescein LC Red for sequence specific detection of DNA 雜交探針檢測(cè)－羅氏專(zhuān)利性技術(shù) Template: Plasmid。 Target: CycA。 Detection Format: Hybridization Probes Standard Calculated concentration +9 +9 +7 +7 +6 +4 +4 +2 +1 +1 H2O +10 +9 +8 +7 +6 +5 +4 +3 +2 +1 H2O 雜交探針的優(yōu)點(diǎn)： Monitoring of PCR with the LightCycler Using Hybridization Probes 專(zhuān)用于 SNP基因分型和突變檢測(cè)的 SimpleProbe SimpleProbe作為一種獨(dú)特的雜交探針只含有一條寡核苷酸探針，能夠特異性的與目的基因上含有 SNP位點(diǎn)的靶序列結(jié)合。探針與靶序列結(jié)合后，釋放出能夠被檢測(cè)到的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)熔點(diǎn)曲線分析中探針釋放的熒光信號(hào)強(qiáng)度的分析，可以得到對(duì)目的基因的多態(tài)位點(diǎn)的準(zhǔn)確分析結(jié)果。 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution。 emission of reporter dye is quenched Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s plementary target 5‘ 3‘p Q R 3‘ 5‘ primer 5‘ 3‘p Q R New Probe Format : SimpleProbe Format 高效低成本的新型探針 R = Reporter (Fluorescein) Q = Quencher 熒光定量 PCR儀的部分應(yīng)用 ? 醫(yī)學(xué)相關(guān)研究 ? 疾病的臨床早期診斷 ? 病原體的含量檢測(cè) ? 合理用藥分子水平的療效研究 ? 疾病的發(fā)病監(jiān)控研究 ? 腫瘤相關(guān)基因腫瘤、耐藥基因的檢測(cè) ? 研究組織或培養(yǎng)細(xì)胞中 mRNA的表達(dá)水平 －各種處理對(duì)細(xì)胞 mRNA含量變化的影響 －比較染病組織與正常組織中各種 mRNA含量差異 ? DNA或 RNA的轉(zhuǎn)染量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果關(guān)系的研究 ? 基因分型及 SNP分析 ? 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及植物研究 重點(diǎn)問(wèn)題說(shuō)明 超高速的熱循環(huán) —— 由于采用空氣迅速改變溫度，以及利用有高表面積 /體積比的光學(xué)玻璃毛細(xì)管模式， 使升降溫速度最高可達(dá) 20℃ /秒，溫控 ≤? ℃ ， 每 20～ 30分鐘便能完成 30～ 40個(gè)循環(huán)。 升降溫?cái)?shù)率唯一可調(diào) —— 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要調(diào)整升降溫速率的系統(tǒng) ~20 ℃ /秒，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。 配套功能強(qiáng)大的分析軟件： （ 1）絕對(duì)定量（具 “ 單點(diǎn)定標(biāo) ” 功能） （ 2）相對(duì)定量（可進(jìn)
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