原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用-文庫吧
2025-04-22 17:52 本頁面
【正文】 探針還有單鏈 DNA（ Single stranded, ssDNA）和雙鏈 DNA（ Double stranded, dsDNA）之分。 ? 早期應(yīng)用的主要是 DNA探針 ? Temin在 70年代研究致癌 RNA病毒時制備了cDNA探針 （ plementary DNA），其基本原理是以 RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase）又稱為 RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以 RNA為模板，按照 RNA的核苷酸順序合成 DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。 cDNA是指互補于 mRNA的 DNA分子。 ? RNA探針 是將特異性的 cDNA片段插入含有 RNA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。 ? 這類載體包括 pSP64和 pSP65，它們具有不同的 啟動子 在多克隆位點的各側(cè)。 Psp64和 pSP65在 sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的 RNA聚合酶，可以控制 RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條 DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄 RNA。從而可以得到與 mRNA同序列的同義 RNA探針（ Sense probe）和與 mRNA互補的反義 RNA探針（ antisense probe），又稱互補 RNA探針（ plementary RNA probe , cRNA）。 ? 通常用同義 RNA探針做為反義 RNA探針的陰性對照。 ? 由于 RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報告認為其雜交率高于 DNA探針的 8倍。 ? DNA合成儀的誕生使制造 寡核苷酸探針 成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性 DNA探針，它是由 DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優(yōu)點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。 原位雜交組織化學(xué)技術(shù) 的基本步驟 ? 大致可分為： ①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ②雜交； ③雜交后處理； ④顯示（ visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。 （一）固定 兼顧三個方面： ? 保持細胞結(jié)構(gòu)， ? 最大限度地保持細胞內(nèi) DNA或 RNA的水平； ? 使探針易于進入細胞或組織。 ? DNA是比較穩(wěn)定的， mRNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于 DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在 RNA的定位上，如果要使 RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋 ISHH的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對 RNA保存所帶來的影響，因組織中 mRNA的降解是很快的。 ? 在固定劑中，最常用的是 多聚甲醛 。 ? 對于 mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液中 1～ 2h，在冷凍前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4℃ 冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。 ? 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入 4%多聚甲醛約 10min，空氣干燥后保存在 70℃ 。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。 ? 在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測 DNA和 mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低 mRNA的含量。 （二）玻片和組織切片的處理 ? 1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片 ? 應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡 24h，清水洗凈烘干， 95%酒精中浸泡 24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在 150℃ 或以上過夜 以去除任何 RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用 硅化 處理，錫箔紙包裹無塵存放。 ? 由于 ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應(yīng)用 粘附劑 預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。 ? 常用的粘附劑有 鉻礬 明膠 液，其優(yōu)點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。 ? 多聚賴氨酸 液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。 ? 近年 Vector Lab (.)推出一種新的粘附劑叫 Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備 500～ 700張載玻片，粘附效果極佳，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應(yīng)用。 ? 2．增強組織的通透性和核酸探針的 穿透性 ? 此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。 ? 增強組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（ detergent）或稱清洗劑 Triton X100、酒精或某些 消化酶 如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（ diastase）等。 ? 這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低 RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。 ? 蛋白酶 K（ Proteinase K） :1μg/ml( 于 Tris/50mmol/L EDTA, ),37℃ 孵育15～ 20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。 ? 蛋白酶 K還具有消化包圍著靶 DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。 ? 在蛋白酶 K
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1