原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 探針對(duì)組織的非特異性背景染色。 ? 蛋白酶 K還具有消化包圍著靶 DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。 ? 2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的 穿透性 ? 此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。 ? 由于 ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用 粘附劑 預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。 ? 在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè) DNA和 mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。 ? 在固定劑中，最常用的是 多聚甲醛 。 ? DNA是比較穩(wěn)定的， mRNA卻絕然不同，非常容易被降解。 ? DNA合成儀的誕生使制造 寡核苷酸探針 成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性 DNA探針，它是由 DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。從而可以得到與 mRNA同序列的同義 RNA探針（ Sense probe）和與 mRNA互補(bǔ)的反義 RNA探針（ antisense probe），又稱互補(bǔ) RNA探針（ plementary RNA probe , cRNA）。 ? RNA探針 是將特異性的 cDNA片段插入含有 RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。 ? DNA探針還有單鏈 DNA（ Single stranded, ssDNA）和雙鏈 DNA（ Double stranded, dsDNA）之分。同時(shí)在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測(cè)出人基因組 DNA中的單拷貝基因。 ? 光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡(jiǎn)單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每 100～ 150個(gè)堿基才能標(biāo)記一個(gè)生物素，對(duì)于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度。 ? 上述生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。 ? Pezzella（ 1987）創(chuàng)建了用 磺基化 DNA探針 來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使 DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識(shí)別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對(duì)雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。 ? 由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等 ?固相雜交 是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。兩條核苷酸單鏈片段，通過氫鍵結(jié)合，形成 DNADNA、 DNARNA或RNARNA雙鏈分子 ?按其作用方式可大致分為兩種：固相雜交和液相雜交 ?液相雜交 是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 ?此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。 ? Orth（ 1970）應(yīng)用 3H標(biāo)記 的兔乳頭狀瘤病毒 cRNA探針 與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測(cè)了病毒 DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。 ? 這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。 ? 生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。 ? 和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間。 ? 根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為 DNA探針、RNA探針、 cDNA探針、 cRNA探針和寡核苷酸探針等。 cDNA是指互補(bǔ)于 mRNA的 DNA分子。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的 RNA聚合酶，可以控制 RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條 DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄 RNA。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于 DNA探針的 8倍。 （一）固定 兼顧三個(gè)方面： ? 保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)， ? 最大限度地保持細(xì)胞內(nèi) DNA或 RNA的水平； ? 使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。在解釋 ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對(duì) RNA保存所帶來的影響，因組織中 mRNA的降解是很快的。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。蓋玻片在有條件時(shí)最好用 硅化 處理，錫箔紙包裹無塵存放。 ? 近年 Vector Lab (.)推出一種新的粘附劑叫 Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備 500～ 700張載玻片，粘附效果極佳，價(jià)格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長(zhǎng)期保存應(yīng)用。 ? 蛋白酶 K（ Proteinase K） :1μg/ml( 于 Tris/50mmol/L EDTA, ),37℃ 孵育15～ 20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。 ? Burns等（ 1987）報(bào)告應(yīng)用 胃蛋白酶 （ Pepsin）20～ 100μg/ml （用 HCl 配） 37℃ 、 30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶 K。 3．減低背景染色 雜交后（ Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 4．防止 RNA酶的 污染 由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有 RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。 （三）雜交 （ H
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