原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用-預(yù)覽頁
【正文】 ybridisation） ? 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 ? 注意事項(xiàng) 1． 探針的濃度 很難事先確定，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信 /噪比值。雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。 ? 在雜交的程序中常規(guī)的加入 30%～ 50%甲酰胺（ for－ mamide）于雜交液中。 ? 從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時(shí)間在 3h左右。 ? 4．雜交嚴(yán)格度（ Hybridization stringency） ? 雜交條件的嚴(yán)格度（ stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。在這種條件下，大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生。 ? 由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在 Tm25℃ 進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信 /噪比減低。單鏈的 RNA探針其雜交信號(hào)大于雙鏈的 cDNA的約 8倍。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。 （四）雜交后處理（ post hybridisation treatment） ? 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 ? 必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。 ? 比較可靠的對(duì)照試驗(yàn) : ?Northern 和 Southern印跡雜交法。再進(jìn)行 ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。 ? 應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記 cRNA探針在理想的 ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè) mRNA，其敏感度可達(dá)到 20個(gè) mRNA拷貝 /每個(gè)細(xì)胞。 ? 正因?yàn)槿绱?，?duì) ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報(bào)告過的新發(fā)現(xiàn)。 使用 地高辛 標(biāo)記的 核酸探針 進(jìn)行 石蠟切片 的 RNA原位雜交 第一天 1） 二甲苯于 37℃ 脫蠟 2次，每次 15分鐘； 2） 無水乙醇浸泡 2次，每次 3分鐘； 3） 95%乙醇浸泡 2次，每次 3分鐘； 4） PBS清洗 3分鐘； 5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡 10分鐘； 6） PBS清洗 10分鐘； 7） 加入胃蛋白酶 25ul/ml， 37℃ 孵育 15分鐘； 8） PBS清洗 2次，每次 3分鐘； 9） HCl孵育 30分鐘； 10） PBS清洗 2次，每次 3分鐘； 11） %無水乙酸和 10分鐘； 12） PBS清洗 2次，每次 5分鐘； 13）預(yù)雜交緩沖液孵育 30分鐘； 14）準(zhǔn)備核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針， 85℃ 加熱 5分鐘，置于冰塊中 10分鐘； 原位雜交操作 流程 15）雜交；第二天 16）將玻片置于 SSC中 2次，每次 5分鐘以去除封片； 17） PBS清洗 3分鐘； 18） RNA酶溶液中（或 ）， 37℃ 孵育 30分鐘； 19） PBS清洗 5分鐘； 20）室溫， 2 SSC清洗 10分鐘； 21） 37℃ ， 1 SSC清洗 10分鐘； 22） 37℃ ， SSC清洗 10分鐘； 23）緩沖液孵育 10分鐘； 24）緩沖液（ 1%正常綿羊血清和 %Triton X100）孵育 30分鐘； 25）加入抗地高辛抗體， 37℃ 孵育 3 小時(shí)； 26）緩沖液清洗 2次，每次 10分鐘； 27）緩沖液清洗 2次，每次 5分鐘； 28）制成 NBT/BCIP暗處保存 3060分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到 16小時(shí)； 29）停止緩沖液的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗； 30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。 18 條帶 7 條帶 原始圖像 DAPI圖像 實(shí)例 : X / Y 著絲點(diǎn)探針 單個(gè)或多個(gè)全染色體（ WCP) 探針 探測(cè)缺失 探測(cè)易位 bcr / abl 雜交到有爪蟾蜍染色體上的衛(wèi)星探針 (SAT1) Multi color ISH 450 500 550 600 650 700 750020214000600080001000012021140001600018000202102202124000260002800030000 T M B D A B N FOptical DensityW a v e l e n g t h ( n m )TMB chr. 1 DAB chr. 15 NF chr. 7 Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI) 多色原位雜交 2. a b c人類頻譜染色體組型分析 a c e4. b d頻譜 FISH ab8.111515157多色原位雜交 實(shí)習(xí)課 ? 實(shí)習(xí)時(shí)間： 共聚焦： 1月 12日 2： 30 ? 共聚焦實(shí)習(xí)地點(diǎn)：科研樓 10樓， Thank
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