原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用(存儲(chǔ)版)
【正文】 驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用 粘附劑 預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片不致脫落。 ? 蛋白酶 K還具有消化包圍著靶 DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。 ? 預(yù)雜交（ Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。加蓋片的目的是防止孵育過(guò)程中的高溫（ 50℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。 ?2． 探針的長(zhǎng)度 ? 一般應(yīng)用于 ISHH探針的最佳長(zhǎng)度應(yīng)在 50～ 100個(gè)堿基之間。但為穩(wěn)妥起見(jiàn)，一般將雜交反應(yīng)時(shí)間定為 16～ 20h。 中嚴(yán)格度 ， Tm 20℃ 至 Tm30℃ 的范圍。 ? 5．硫酸葡聚糖（ Dextran sulphate）和甲酰胺（ formamide） ? 硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。 ? 通過(guò)雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 （六）對(duì)照實(shí)驗(yàn)和 ISHH結(jié)果的判斷 ? 和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，并非 ISHH的任何陽(yáng)性信號(hào)都是特異性的，故必須同時(shí)有對(duì)照試驗(yàn)以證明其特異性。 ?由于同義 RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行 ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。 ? 因?yàn)槿缜八?，影?ISHH實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒?yàn)取材后未及時(shí)的固定或冷凍可由于組織中 mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。 使用 Vysis AneuVysion探針組對(duì) 13, 18, 21, X, Y 染色體進(jìn)行雜交 普通圖像 分類(lèi)色圖像 5號(hào)染色體上雜交了 7種探針，這些探針在位置上分別有部分重疊。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。 ?如同免疫組化的吸收試驗(yàn)一樣，事先與特異性的 cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。 ? 細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀（ puter – assisted image analysis）檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。實(shí)驗(yàn)證明， cRNA產(chǎn)生的信號(hào)比雙鏈 cDNA要強(qiáng)。一般來(lái)說(shuō)， 低嚴(yán)格度 （ low stringency）雜交及沖洗條件在 Tm 35℃ 至 Tm –40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。 ? 由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在 Tm25℃ 左右，即比 Tm減低 25℃ ，大約在 30～ 60℃ 之間 ? 根據(jù)探針的種類(lèi)不同，溫度略有差異， RNA和 cRNA探針一般在 37～ 42℃ 左右，而 DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為 DNA的，則必須在 80～ 95℃ 加熱使其變性，時(shí)間 5～ 15min，然后在冰上擱置 1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有 2 SSC的溫盒內(nèi)，在37～ 42℃ 孵育雜交過(guò)夜。 ? 必須強(qiáng)調(diào)的是，加雜交液的量要適當(dāng)，以10～ 20μl/ 每張切片為宜。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。 ? 但也有報(bào)道乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善 ISHH的信 /噪比例。 ? 這種廣泛的去蛋白作用無(wú)疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低 RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。 （二）玻片和組織切片的處理 ? 1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片 ? 應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡 24h，清水洗凈烘干， 95%酒精中浸泡 24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在 150℃ 或以上過(guò)夜 以去除任何 RNA酶。相反，在 RNA的定位上，如果要使 RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類(lèi)濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。 ? 由于 RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。該酶以 RNA為模板，按照 RNA的核苷酸順序合成 DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱(chēng)逆轉(zhuǎn)錄。 Boeringer Mannhem Bio－ chemisca于 1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場(chǎng)。 ? 生物素標(biāo)記探針技術(shù) 是 Brigat（ 1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測(cè)了病毒 DNA，通過(guò)生物素與抗生物素結(jié)合，過(guò)氧化物酶 抗過(guò)氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒 DNA在細(xì)胞中的定位。 ? 1969年， BuongiornoNardelli和 Amaldi John 利用 同位素標(biāo)記核酸探針 進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。原位雜交技術(shù) in situ hybridization 核酸分子雜交技術(shù) ?在研究 DNA分子復(fù)制 原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。 ? Aromase gene ?The rat brain section In situ hybridization 培養(yǎng)細(xì)胞 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展 ? 1961年， Hall 液相核酸雜交技術(shù) ? 1969年， Gall 和 Pardue 用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。 ? 本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化 DAN探針標(biāo)記簡(jiǎn)便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。 ? 近年來(lái)， 地高辛 （ Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。 ? 早期應(yīng)用的主要是 DNA探針 ? Temin在 70年代研
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