【正文】 IV核蛋白（ NP）基因特異的引物，建立了可以直接從臨床病料的感染組織中檢測(cè)所有亞型禽流感病毒的。 RTPCR診斷技術(shù)經(jīng)試驗(yàn)表明，可應(yīng)用于對(duì)所有亞型禽流感感染的早期快速診斷，具有敏感、特異、快速的特點(diǎn)；另外，為特異、快速地檢出可引起高致病力禽流感大爆發(fā)的 H5或 H7亞型禽流感病毒的感染，通過(guò)對(duì)比禽流感病毒血凝素基因保守序列，設(shè)計(jì)了特異性引物 ,建立了對(duì)臨床病料或雞胚接種物中 H5和 H7亞型禽流感病毒進(jìn)行快速分型檢測(cè) RTPCR診斷技術(shù)；此外， H5和 H7亞 型禽流感病毒分子分型診斷技術(shù)在特異地檢出 H5或 H7亞型禽流感病毒感染的同 時(shí)，還可根據(jù)應(yīng)用特定引物經(jīng) RTPCR擴(kuò)增出的 H5和 H7包括裂解位點(diǎn)在內(nèi)的 HA基因片段，經(jīng)測(cè)序推導(dǎo)出的氨基酸序列來(lái)判斷 H5或 H7亞型禽流感病毒的致１２ 病性高低，在為我國(guó)禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先進(jìn)、有效的早期快速診斷技術(shù)和監(jiān)測(cè)手段的同時(shí)，也為高致病力禽流感防制 爭(zhēng)取到極為寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間。 在技術(shù)流程方面，主要包括樣本采集和制備，反應(yīng)體系準(zhǔn)備，熒光定量 PCR反應(yīng)及檢測(cè)等幾個(gè)部分。 免疫熒光法 免疫熒光技術(shù)就是熒光抗體技術(shù)（ FAT）。 IFT早在 1961年就開(kāi)始用于人類(lèi)流感的快速診斷。1984年美國(guó)賓西法尼亞州爆發(fā)禽流感時(shí) Skeeles將 IFT首次用于 AIV的檢測(cè)。 IFT最早用于病毒的鑒定和定位病毒感染細(xì)胞中特異性抗原，主要是核內(nèi)熒光；用 MP抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也有部分熒光。用于禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法，即在組織切片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光，一種 AIV的熒光抗體可用來(lái)檢測(cè)不同亞型的其他病毒。 IFT用于診斷具有快速、簡(jiǎn)便、敏感性好的特點(diǎn)，而且費(fèi)用較低。其敏感度同病毒的分離鑒定相當(dāng)，有時(shí)高于用雞胚進(jìn)行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標(biāo)本中出現(xiàn)的假陽(yáng)性） 問(wèn)題。間接免疫熒光技術(shù)也可以用來(lái)檢測(cè)核蛋白（ NP）基質(zhì)蛋白（ MP）抗原與抗體的反應(yīng)，其敏感性很高。但對(duì)抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對(duì)純化的病毒粒子進(jìn)行裂解。 綜上述， H5禽流感病毒的檢測(cè)方法各有利弊。從定性到定量，快速診斷應(yīng)該更多的用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，而 RTPCR，免疫熒光， ＮＡＳＢＡ檢測(cè)方法 更適用于實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。我個(gè)人認(rèn)為，金標(biāo)法 HA檢測(cè)試劑盒更適合現(xiàn)場(chǎng)使用，應(yīng)大力開(kāi)發(fā)并各省 CDC推廣使用。 目前存在的問(wèn)題：對(duì)于咽拭樣品的特異性不好（約 91%），有待提高。 解決方法：對(duì)現(xiàn)有的標(biāo)記系統(tǒng)，包被系統(tǒng)以 及緩沖系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整。 單克隆抗體的進(jìn)一步篩選。 （部分內(nèi)容摘自國(guó)家農(nóng)業(yè)部《 H5N1高致病性禽流感防治手冊(cè)》） 4 種 ELISA 試劑篩查獻(xiàn)血人群抗 HTLV 結(jié)果評(píng)價(jià) 康麗娜 人類(lèi) T淋巴細(xì)胞白血病病毒（ HTLVⅠ /Ⅱ）在全球廣泛存在，主要流行于日本西南部、加勒比海和中、南非洲、巴布亞新幾內(nèi)亞等部分地區(qū)。 20世紀(jì) 80年代我國(guó)呂聯(lián)煌等在福建省沿海地區(qū)１３ 發(fā)現(xiàn)了一個(gè) HTLVI流行區(qū)，隨后廣東、新疆及其它一些地區(qū)都相繼發(fā)現(xiàn)了多例 HTLVI感染和HTLVI相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。因此，在我國(guó)獻(xiàn) 血者中開(kāi)展 HTLV感染的篩查已成為一個(gè)迫切需要認(rèn)真考慮的問(wèn)題，其中尤以篩查試劑的選擇最為重要。 1 材料與方法 血清標(biāo)本 標(biāo)本 797份采自來(lái)本站獻(xiàn)血的獻(xiàn)血者。 抗體篩查試劑盒 進(jìn)口 HTLVⅠ /Ⅱ ELISA抗體檢測(cè)試劑盒分別為新加坡 Genelabs公司和美國(guó) UBI公司產(chǎn)品；國(guó)產(chǎn)試劑盒 2種，為上海某廠家的 HTLV（Ⅰ +Ⅱ）抗體 ELISA試劑盒以及北京某廠家的 HTLV（Ⅰ +Ⅱ）抗體 EIA試劑盒。其中僅北京試劑為雙抗原夾心法，其余均為間接法試劑。 抗體確證試驗(yàn) 以 Genelabs公司的 HTLVⅠ /Ⅱ 4 種 ELISA試劑陽(yáng)性血清的 Western blot（ WB）確證。 血清盤(pán)考核 為進(jìn)一步驗(yàn)證比較試劑質(zhì)量 ,分別用 Genelabs試劑和北京試劑檢測(cè)美國(guó)BBI HTLV參比血清。 主要儀器 美國(guó)伯樂(lè) 550酶標(biāo)儀，美國(guó)寶特 Elx50洗板機(jī)。 2 結(jié)果 四種 HTLV抗體 ELISA試劑盒檢測(cè) 797份標(biāo)本結(jié)果見(jiàn)表 1。其中只有 4份標(biāo)本四種試劑的檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性，除北京試劑外，其它三種間接酶免法試劑各出現(xiàn) 4份、 5份、 11份互不相同的陽(yáng)性標(biāo)本。三種間接 酶免法試劑的陽(yáng)性率經(jīng)配對(duì)統(tǒng)計(jì)處理χ 2=， P﹥ ，均無(wú)差異。而北京試劑與上海、 Genelabs、 UBI三種試劑配對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果分別為：χ 2=， P﹤ ；χ 2=， P﹥ 。χ 2=， P﹥ ，與國(guó)外試劑不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)雙抗原夾心法試劑質(zhì)量與進(jìn)口試劑相當(dāng)，國(guó)產(chǎn)兩種試劑存在差異則與國(guó)產(chǎn)間接法試劑特異性不高有關(guān)。 表 1 四種 ELISA試劑盒檢測(cè)抗 HTLV結(jié)果比較 北京 上海 Genelabs UBI ＋ － 合計(jì) ＋ － 合計(jì) ＋ － 合計(jì) ＋ 4 0 4 4 0 4 4 0 4 １４ － 11 782 793 4 789 793 5 788 793 合計(jì) 15 782 797 8 789 797 9 788 797 24份 ELISA抗 HTLV陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng) Western blot（ WB）確證， 4份共同陽(yáng)性的標(biāo)本為抗 HTLVⅠ陽(yáng)性，蛋白印跡帶型表現(xiàn)為： 2條 ENV帶（ GD21和 rgp462Ⅰ）及 GAG帶 (p19和 /或 p24)陽(yáng)性，其它20份標(biāo)本都無(wú) HTLV特異反應(yīng)帶出現(xiàn)。 3 結(jié)論 進(jìn)行獻(xiàn)血者 HTLV感染的篩查必須具備合適的檢測(cè)試劑盒。既往國(guó)內(nèi)僅 有間接免疫熒光法（ IFA）試劑供應(yīng)，該法由于操作相對(duì)復(fù)雜，尤其是結(jié)果的判斷需要昂貴的熒光顯微鏡，而且受主觀因素影響大，因此難以作為篩選試劑，而進(jìn)口的 ELISA試劑或明膠微粒凝集法（ GPA）試劑價(jià)格昂貴，這也從客觀上阻礙了我國(guó) HTLV相關(guān)研究的進(jìn)行及篩檢策略的實(shí)施。筆者在 HTLV流行區(qū)對(duì)剛問(wèn)世不久的而且是目前僅有的兩種國(guó)產(chǎn) HTLV抗體 ELISA試劑與兩種國(guó)際上較常見(jiàn)的試劑同時(shí)進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部試劑的敏感度均可達(dá)到 100%，但 3種間接法試劑均出現(xiàn)了多份假陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅在 30%左右，而北京的雙抗原夾 心法試劑則未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，北京試劑能以較高的 S/CO值檢出美國(guó) BBI HTLV Panel全部陽(yáng)性血清，說(shuō)明其靈敏度明顯高于國(guó)外試劑。這可能與試劑盒所采用的方法不同有關(guān)。由于雙抗原夾心法試劑以有別于包被抗原的 HTLV酶標(biāo)特異性抗原代之于間接法的廣譜性酶標(biāo)二抗，此雙重識(shí)別機(jī)制致使假陽(yáng)性不易出現(xiàn)，特異性增高。其次，間接法采用稀釋血清加樣，降低了樣品的 HTLV特異性抗體濃度，而夾心法采用原 (或半 )倍血清加樣，提高了檢出率，增大了靈敏度。另外，間接法在操作上采用兩步加樣，而夾心法為一步加樣，避免了加樣誤差。因此 在方法學(xué)上夾心法比間接法具有一定的優(yōu)勢(shì)。 （摘自：中國(guó)輸血雜志 2020年 4月第 15卷第 2期） １５ HIV— 1 0 亞型：對(duì)診斷和艾滋病病原體起源的意義 賈雪榮 背景： 1990年首次報(bào)道的 O— 型分離株與其第二個(gè)分離株，是從一來(lái)自喀麥隆的病人分離出的，從各 O— 亞型分離株與兩株分析過(guò)的病毒的異源性認(rèn)識(shí)到，這是 HIV— 1的一個(gè)新亞型。 流行病學(xué)：加蓬的初步血清學(xué)調(diào)查報(bào)告其流行率為 3％，喀麥隆的 HIV感染中占 5％。在與喀麥隆接壤的中非共和國(guó)地區(qū)，迄今尚未鑒定出 HIV— O，其他的非洲國(guó)家尚無(wú)研究報(bào)道。馬拉維、肯尼亞、象牙海岸和扎伊爾的血清分析指出，這些地區(qū)的 HIV— O的流行率并不高。尼日爾的首府尼亞美發(fā)現(xiàn) 2名 HIV— O感染者，其血清是 1990年因其他原因采集的。在歐洲迄今很少報(bào)道 HIV— O病例，病人多與中非有關(guān)。比利時(shí)已有 5例，法國(guó) 14例。巴黎報(bào)道的 HIV— O感染者的性伴研究表明 HIV— O與 HIV— 1的傳播感染性相似，致病機(jī)制亦無(wú)區(qū)別， HIV— O的致病性并不亞于 HIV— l. 診斷 ELISA 估計(jì)約 80％一 90％含有 HIV— O抗體血清，可用抗 HIV— l十 2ELISA試劑 檢出，反應(yīng)可用 HIV— 2抗原的交叉反應(yīng)解釋。 1988年之前， HIV— 2抗體的識(shí)別依靠 HIV— l出現(xiàn)的交叉反應(yīng)。當(dāng)用原病毒材料制備試劑盒時(shí)，交叉反應(yīng)特別高。純化 HIV制備的試劑現(xiàn)今已不再應(yīng)用。 比較各 HIV變異株的外殼蛋白， HIV— l與 HIV— 2有 60％的差異， HIV— l與 HIV— O之間約 45％， HIV— 2與 HIV— O之間約 50％的差異。 ELISA較寬的交叉反應(yīng)，說(shuō)明用的是保守區(qū)，特別是外殼蛋白作為抗原材料。對(duì)診斷更為重要的是那些未識(shí)別出來(lái)的含抗 HIV— O血清，按抗原夾心法建立起的試劑，對(duì)抗 HIV— O識(shí)別 甚差，原則上必須有兩個(gè)位點(diǎn)，才能顯示所要求的反應(yīng)性。 競(jìng)爭(zhēng) ELISA 有兩種試劑，采用自然和重組 HIV— 1抗原，競(jìng)爭(zhēng)歐洲和美國(guó)感染者的抗 HIV。競(jìng)爭(zhēng) ELISA顯示高度特異性，抗 HIV— O用此試劑僅儉出臨界值，或不能檢出，這種試劑識(shí)別抗 HIV— O的缺點(diǎn)，正如在 HIV— 2出現(xiàn)的問(wèn)題，可通過(guò)加入 HIVO抗原而被排除。 免疫印跡試驗(yàn) 免疫印跡試驗(yàn)是一最常用的反應(yīng)性 HIV篩查試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)與用電泳分離開(kāi)的病毒蛋白的反應(yīng)，檢出 HIV— l抗體、多采用 HIV B亞型作為抗原，多數(shù)含有 HIV— 0抗體的標(biāo)本，通過(guò)免疫印跡反應(yīng)得到“確證”，也就是說(shuō)顯色檢出 Gp160和 Gp4l，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，抗 HIV— O識(shí)別核蛋白較弱，一些血清，其中含有抗 HIV— O，很少出現(xiàn)交叉反應(yīng)，結(jié)果條帶著色極弱，粗略一看可能錯(cuò)判，在法國(guó)也發(fā)現(xiàn)假陰性結(jié)果，可應(yīng)用 HIV— 1亞型 B抗原識(shí)別，這種反應(yīng)模式，免疫印跡試驗(yàn)作為抗 HIV— O的驗(yàn)證試驗(yàn)，其中應(yīng)含有 HIV— O抗原， HIV— O的反應(yīng)性相當(dāng)于現(xiàn)今用抗 HIV— 1作免疫印跡試驗(yàn)的反應(yīng)性?？?HIV— O與 B亞型的反應(yīng)性有的極差，可用二種方法，１６ 一是再與 HIV— O作免疫印跡試驗(yàn)，其 優(yōu)點(diǎn)是抗原具有同一性。另一方法是在提供的免疫印跡試驗(yàn)試劑中加入具有反應(yīng)性的保守區(qū)肽，這樣可排除抗 HIV— O標(biāo)本的漏檢。 免疫熒光 按病毒和 HIV在細(xì)胞中濃度的不同， HIV抗原和抗 HIV— O之間有較好的交叉反應(yīng)，用 HIV— 1感染的細(xì)胞作免疫熒光， H1V— O抗體滴度低時(shí)，應(yīng)倍加小心判斷結(jié)果。 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) PCR是通過(guò)加入引物和引物與核酸在一定的溫度相結(jié)合，非常特異地檢測(cè) HIV核酸的方法。目前所建立的試驗(yàn)，用引物可識(shí)別 HIV— 1的 A至 F亞型，有時(shí)也可顯示與 HIV— 2核酸的共同反應(yīng)性，一般 HIV— O核酸不能用 PCR法檢出，因此， PCR對(duì) HIV— O不能識(shí)別，反之，如用特異性引物，可特異的擴(kuò)增出 HIVO核酸片段，作出診斷，作 HIV— O PCR推薦選用 Cam5和 Cam3引物，可取得很好的結(jié)果。 展望 根據(jù)長(zhǎng)期保留的非洲的血清分析， H1V是一新近的傳染病，人類(lèi)的傳播在扎伊爾始于 1959年，烏千達(dá)始于 1972年，馬拉維始于 1974年， HIV— 2似乎在相同的時(shí)間出現(xiàn)相應(yīng)流行， 1988年之后在象牙海岸的首府阿比讓?zhuān)?265例艾滋病病人中至少 11例，確診為單純 HIV— 2感染，與 H1V相似的病毒也在猿猴中傳播， 例如 SIV— 1在黑猩猩， SIV— 2在白面猴或長(zhǎng)尾猴中傳播，這些種系是自然感染的，而不是在與人類(lèi)接觸后或在飼養(yǎng)過(guò)程中被感染的，但是獼猴是一個(gè)例外，是在飼養(yǎng)后感染SIV— 2的。如將猿猴病毒與人類(lèi)的病毒相比較， H1V— l與 SIV— 1有很大的相似性， SIV— l似乎是H1V— l和 HIVO之間最早的聯(lián)親。 如果對(duì)免疫缺陷病毒的演化史加以分析還可設(shè)想，可能有其他尚未知的 HIV— U(U— 未知 )存在。迄今僅在黑猩猩中發(fā)現(xiàn)一種免疫缺陷病毒，而亞洲猿猴、馬來(lái)猩猩、長(zhǎng)臂猿和獼猴則無(wú)，經(jīng)對(duì)大猩猩調(diào)查，也末得出有免疫缺陷病毒感染 的最后結(jié)論。獼猴的分支形成白面猴、狒狒和山魈，與 HIV— 2／ SIV— 2有緊密的聯(lián)系，人科 (黑猩猩與人類(lèi) )則伴有 HIV— 1／ SIV— l感染，亞洲猿 (馬來(lái)猩猩、長(zhǎng)臀猿和獼猴 )不感染 SIV，同樣南美猿也不受感染，這些種系顯然是在 3000萬(wàn)年前，從共同的靈長(zhǎng)目分支出來(lái)的，亞洲的獼猴如同狒狒群體一樣，伴有 STLV— l感染，這是一種與 HTLV— l相似的致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒。 SIV與中非非洲大陸相關(guān)，假如考慮到各種猿類(lèi)很少見(jiàn)或者完全不出現(xiàn)免疫缺陷病毒感染，是因?yàn)閷?duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒適應(yīng)的結(jié)果，這將是一有力的證據(jù)。回顧靈長(zhǎng)目的演化過(guò)程 可以理解，為何人類(lèi)的演化與非洲地區(qū)相關(guān)。 假如可以排除動(dòng)物較后期感染慢病毒和排除不同種系在一定的時(shí)間內(nèi)交叉感染，免疫缺陷病毒與靈長(zhǎng)目長(zhǎng)期協(xié)同演化的設(shè)想是有意義的，除了在各猿類(lèi)種系演化的假說(shuō)之外，可以肯定免１７ 疫缺陷病毒也有一個(gè)長(zhǎng)期演化過(guò)程，否則我們不可能今日