過(guò)氧化物酶(pod)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳(已改無(wú)錯(cuò)字)
2022-09-15 17:05:54 本頁(yè)面
【正文】 的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定同工酶，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離、鑒定土豆、豆芽過(guò)氧化物酶同工酶。同工酶染色：根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶。過(guò)氧化物酶能催化過(guò)氧化氫使聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕色產(chǎn)物，據(jù)此即可將該酶在凝膠中顯色定位。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑材料土豆和豆芽?jī)x器：DYCZ24E電泳槽、DYY11型和DYY12型三恒多用電泳儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量進(jìn)樣器、芬蘭可調(diào)移液器，研缽，50mL燒杯，量筒、大培養(yǎng)皿等玻璃器皿。試劑：電泳試劑貯存液配置見(jiàn)附表(附表1)。染色液成分：,聯(lián)苯胺溶液(2g聯(lián)苯胺溶于18mL溫?zé)岜姿嶂?再加入蒸餾水72mL)20mL,%(%)過(guò)氧化氫20mL,蒸餾水60mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟：（教師演示，學(xué)生安裝）注意事項(xiàng)：在整個(gè)過(guò)程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。(濃度10%)分離膠配方(濃度10%): TrisHCl溶液: 分離膠PAG溶液: 蒸餾水: 10%TEMED:40μl 10%AP: 40μl將上述溶液充分混勻,立即全部倒入安裝好的制膠玻板中,為使分離膠界面平整,。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。(%)濃縮膠配方(%): TrisHCl溶液: mL 濃縮膠PAG溶液: 40%蔗糖溶液: 10%TEMED:30μl 10%AP: 30μl將上述溶液充分混勻,在聚合完全的分離膠上,倒入濃縮膠,（注意在倒入濃縮膠前要去掉分離膠表層的水）同時(shí)插入梳子,直到溶液裝滿(mǎn)和梳子插平為止。再靜置40min左右,濃縮膠聚合完全后為乳白色。注意事項(xiàng)：A、在整個(gè)過(guò)程中要將制膠模具垂直放在桌面上，不容許傾斜。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應(yīng)盡快用移液槍延高板的一側(cè)慢慢加入膠板中C、膠制作完成后，松開(kāi)卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。要注意低板在內(nèi)側(cè)。取適量(2g)的馬鈴薯于研缽中,加1mL的PBS(磷酸緩沖液,),于冰上研磨至勻漿狀,在臺(tái)式離心機(jī)中以8000rpm離心5min，取上清,即為粗酶提取液,其中含有所需的POD。另外,豆芽研磨可取4g左右,同樣加入1mL的PBS。在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側(cè),勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預(yù)冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒(méi)過(guò)低板。
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