【正文】 生產(chǎn)過程盡量避免或減少工業(yè)強酸、強堿的使用，改善操作條件；(2) 微生物轉(zhuǎn)化法專一性強，具有較好的立體選擇性和區(qū)域選擇性。但是，其仍有不足。一方面，特殊底物甾體類物質(zhì)通常具有較強的疏水性，使得其難以擴散進(jìn)入細(xì)胞與轉(zhuǎn)化酶接觸反應(yīng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低；另一方面，分支桿菌發(fā)酵是細(xì)菌發(fā)酵，不像酵母等真菌發(fā)酵一樣具有很強的魯棒性，滅菌成本高，在一定程度上限制了半合成法生產(chǎn)甾體激素中間體的工業(yè)化應(yīng)用。生物轉(zhuǎn)化甾體化合物生產(chǎn)AD的方法水相中微生物生物轉(zhuǎn)化方法甾體化合物在水中溶解度極低，限制了微生物利用其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的能力。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為底物進(jìn)入胞漿的屏障會極大地影響生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率。萬古霉素、氨基乙酸、卵磷脂、魚精蛋白、多粘菌素B九肽、乙胺丁醇、桿菌肽和聚乙烯亞胺等都可以引起Mycobacterium 相關(guān)菌株的細(xì)胞壁缺失。萬古霉素和氨基乙酸通過降低細(xì)胞壁上多肽的交聯(lián)度而影響肽聚糖的厚度。魚精蛋白通過改變非共價結(jié)合油脂的相關(guān)比例而影響細(xì)胞壁雙分子層的結(jié)構(gòu)完整性和流動性。關(guān)于Tween、Triton X－100、Triton X－114 和卵磷脂對植物甾醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)AD（D）的影響也有許多研究。卵磷脂既不改變水溶液的界面張力也不會導(dǎo)致如使用表面活性劑Tween 80 易產(chǎn)生泡沫的問題，具有良好的生物相容性，對細(xì)胞的生長沒有不利的影響，卵磷脂處理后增加了細(xì)胞膜透性，使甾體化合物側(cè)鏈降解產(chǎn)生AD的比活力提高了3倍。環(huán)糊精在AD生產(chǎn)方面的應(yīng)用有廣泛的報道。環(huán)糊精可形成包埋化合物，從而有效地提高水相中不溶性有機化合物的微生物轉(zhuǎn)化能力。采用環(huán)糊精包埋植物甾醇后利用Mycobacterium sp．NRRL B－3683 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可以有效地提高AD產(chǎn)量。Donova 等研究了甲基化－β－環(huán)糊精對Mycobacterium sp． VKM Ac－1816D 生長、AD（D）產(chǎn)量的影響， 發(fā)現(xiàn)甲基化－β－環(huán)糊精使微生物脂雙層紊亂，使得結(jié)合在細(xì)胞壁上的甾體轉(zhuǎn)化酶釋放。兩相體系中的生物轉(zhuǎn)化方法Flygare 等采用雙水相體系利用Mycobacterium sp． 生物轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)AD和ADD時，采用PEG、葡聚糖和Brij 35，PVP、葡聚糖和Brij 35 以及PVP、葡聚糖和吐溫3 種生物轉(zhuǎn)化體系。Stefanov等用豆油、葵花子油、聚丙烯乙二醇（PPG）和硅油來增加植物甾醇的溶解度，其轉(zhuǎn)化為AD 和ADD 的轉(zhuǎn)化率顯著提高。Cruz 等研究了在有機溶劑－水兩相系統(tǒng)中不同有機溶劑對β－豆甾醇側(cè)鏈降解生產(chǎn)AD 的影響，用Mycobacterium sp． NRRL B－3805生物轉(zhuǎn)化β－豆甾醇生產(chǎn)AD，在含有10 g/L酵母浸膏和磷酸緩沖液（pH 7．0）的培養(yǎng)基中獲得了比含有磷酸緩沖液（pH 7．0）、NH4Cl （2 g/L）， MgSO47H2O（0．14 g/L）和果糖（10 g/L）的合成培養(yǎng)基更好的效果。Santos等在PEG－谷氨酸鈉的雙水相體系中采用Arthrobacter simplex 對氫化可的松進(jìn)行△1－脫氫作用，獲得了比PEG－羥基化淀粉或PEG－磷酸鉀雙水相體系更高的底物轉(zhuǎn)化率和微生物/甾體化合物分離效率。濁點系統(tǒng)中的生物轉(zhuǎn)化方法濁點系統(tǒng)（Cloud point systems，CPS）為維持微生物存活及酶活性提供了一個有效的微水相環(huán)境，被水相微囊包圍的微生物均勻地分散于富含表面活性劑的連續(xù)相中，因此底物和有機相的毒性和抑制性都顯著降低。生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在含有微生物的水相微囊中，產(chǎn)物被萃取到表面活性劑形成的凝聚層中。Wang 等采用此方法用微生物進(jìn)行了膽固醇轉(zhuǎn)化為ADD的研究， 表明采用非離子型表面活性劑Triton X－100和Triton X－114組成一個新型的兩相分配生物反應(yīng)器，在此體系中膽固醇生物轉(zhuǎn)化為ADD的效率有了較大提高。固定化微生物的生物轉(zhuǎn)化方法采用固定化微生物細(xì)胞進(jìn)行了甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化。在一個分批轉(zhuǎn)化過程中，采用活化氧化鋁載體固定化Mycobacterium sp． NRRL B－3683細(xì)胞，以1 g/L 的膽固醇為底物，使得ADD 每天的產(chǎn)率達(dá)到了0．19 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為77％，固定化微生物的半衰期超過了45 d。果膠酸鈣固定化A． simplex ATCC 6946時，相對于為固定化生物轉(zhuǎn)化過程，在水相和油相培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)AD 轉(zhuǎn)化為ADD 的效率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Llanes等研究了使用固定化Mycobacterium sp． 在有機生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行豆甾醇側(cè)鏈選擇性降解的可能性， 研究發(fā)現(xiàn)在Celite matrices 表面存在一定的水化層對于豆甾醇轉(zhuǎn)化為AD（D）是很必要的。Claudino等研究了采用硅樹脂板和Celite為固定化Mycobacterium sp．的載體進(jìn)行豆甾醇轉(zhuǎn)化為AD，當(dāng)豆甾醇初始濃度為0．482 mmol/L，細(xì)胞濃度為1 mm 板上固定1．4 mg 時，AD 的產(chǎn)量為0．436mmol/L，將Mycobacterium sp．固定化在硅樹脂板上的效果要比固定在Celite上好。微乳化和脂質(zhì)體的生物轉(zhuǎn)化體系微乳化（MEs）相對兩相體系提供了一個傳質(zhì)面積顯著提高的方法。Stefan 等報道在水包油的微乳化體系中E． coli、Saccharomyces cerevisiae 和Rhodotorula minuta 的細(xì)胞存活率在70％～80％之間。Malaviya 等采用A． simplex 研究了基于微乳化體系的幾個培養(yǎng)體系對轉(zhuǎn)化的影響，在這一穩(wěn)定的MEs 體系中豆甾醇的最大溶解度高達(dá)8 g/L，在此體系中轉(zhuǎn)化2 g/L 的豆甾醇得到的AD 最高產(chǎn)量為465．86 mg/L。Llanes等利用固定化A． simplex成功地對多薄層膠囊包埋的AD 進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，而在水相中轉(zhuǎn)化進(jìn)行3 h 后0．63 mmol/L 的AD僅有50％得以轉(zhuǎn)化，而脂質(zhì)體包埋的1 mmol/L 的AD在2 h內(nèi)得以完全轉(zhuǎn)化。微生物生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)雄烯二酮是當(dāng)前研究的熱點，集中的研究方向應(yīng)在于獲得更加廉價和有效的生物轉(zhuǎn)化過程，主要是以下幾個方面：①選育高產(chǎn)的微生物菌種；②提高廉價底物的利用率；③轉(zhuǎn)化過程優(yōu)化；④提高轉(zhuǎn)化體系中甾體化合物的溶解度；⑤發(fā)酵過程優(yōu)化，包括很多方面的新型生物反應(yīng)器設(shè)計、培養(yǎng)基優(yōu)化、操作參數(shù)優(yōu)化、過程控制和放大培養(yǎng)等。從目前的生產(chǎn)企業(yè)來看，主要是河北達(dá)瑞生物科技股份有限公司、菏澤賽托生物科技有限公司、廣東本科生物工程股份有限公司和保定九孚生化有限公司（供應(yīng)天藥）在生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá)1220噸。另外，山東東藥藥業(yè)股份有限公司、宜城共同藥業(yè)有限公司、湖南諾凱生物醫(yī)藥有限公司和河北眾盛生物科技有限公司已經(jīng)上馬該項目，預(yù)計2014年也會有投產(chǎn)。表 2 2013年雄烯二酮生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)量企業(yè)名稱產(chǎn)量（噸）河北達(dá)瑞生物科技股份有限公司120菏澤賽托生物科技有限公司300廣東本科生物工程股份有限公司100保定九孚生化有限公司600其他100合計12201. 北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司基于生物轉(zhuǎn)化年產(chǎn)120噸雄甾二烯二酮（ADD）高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程項目通過批準(zhǔn) 2011年6月，國家發(fā)展改革委批準(zhǔn)了北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司基于生物轉(zhuǎn)化年產(chǎn)120噸雄甾二烯二酮(ADD)高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程項目。項目主要推動生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在生產(chǎn)雄甾二烯二酮方面的應(yīng)用，實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)雄甾二烯二酮的產(chǎn)業(yè)化。項目通過建設(shè)形成年產(chǎn)120噸雄甾二烯二酮的生產(chǎn)能力。項目建設(shè)地點重慶市，建設(shè)期30個月。2. 國家發(fā)展改革委同意浙江仙琚制藥股份有限公司生物轉(zhuǎn)化法年產(chǎn)140噸4雄烯二酮高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程列入國家微生物制造高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項按照《國家發(fā)展改革委辦公廳關(guān)于請組織申報微生物制造高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項的通知》（發(fā)改辦高技[2009]537號）的要求，我委對申報項目進(jìn)行了審理，根據(jù)《國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目管理暫行辦法》的規(guī)定，同意浙江仙琚制藥股份有限公司生物轉(zhuǎn)化法年產(chǎn)140噸4雄烯二酮高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程列入國家微生物制造高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項。3. 浙江客商在撫州高新區(qū)投資興建4雄烯二酮（4AD）生產(chǎn)項目2013年1月，撫州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)成功引進(jìn)浙江客商投資興辦的4雄烯二酮（4AD）及稀貴金屬催化劑生產(chǎn)項目。該項目主要使用4AD作為原料合成甾體激素，加工金屬鈀或者含鈀的催化劑。項目投資總額為2億元，占地100畝。項目建成投產(chǎn)后，預(yù)計年銷售收入可達(dá)5億元，上交稅金2000萬元。4. 廣東本科生物工程股份有限公司植物甾醇生物轉(zhuǎn)化雄烯二酮生產(chǎn)皮質(zhì)激素類原料藥項目廣東本科生物工程股份有限公司植物甾醇生物轉(zhuǎn)化雄烯二酮生產(chǎn)皮質(zhì)激素類原料藥項目位于汕頭保稅區(qū)C06地塊本科工業(yè)園，公司通過收購保稅區(qū)工業(yè)園內(nèi)已建成的工業(yè)廠房和設(shè)備，對廠區(qū)發(fā)酵車間、提取車間、公用工程進(jìn)行了內(nèi)部局部改造和設(shè)備更換，本項目通過引進(jìn)植物甾醇生物轉(zhuǎn)化雄烯二酮生產(chǎn)皮質(zhì)激素類原料藥技術(shù)，利用基因工程方法，通過專屬功能的特異性菌種，以植物甾醇為底物進(jìn)一步發(fā)酵法，實現(xiàn)項目年產(chǎn)200噸雄烯二酮。項目總投資12000萬。5. 湖北廣濟藥業(yè)股份有限公司廣濟產(chǎn)業(yè)園一期建設(shè)項目擬建工程主要建設(shè)內(nèi)容：由主體工程、公輔工程、環(huán)保工程、儲運工程及其它工程組成，項目建成后，生產(chǎn)規(guī)模為2000噸/年核黃素、50噸/年β胡蘿卜素生產(chǎn)線、100噸/年雄烯二酮（AD）、2萬噸/年L乳酸。，其中環(huán)保投資5327萬元。6. 上海新華聯(lián)制藥新型COX2抑制劑與皮質(zhì)激素類原料項目，建成年產(chǎn)20噸依托昔布原料藥生產(chǎn)線并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；按GMP2010版要求，建設(shè)具備年產(chǎn)2000萬片依托昔布生產(chǎn)能力的制劑生產(chǎn)線；進(jìn)行依托昔布原料藥EDQM的注冊申報，獲得歐盟許可；同時組織SFDA的首仿注冊申報及GMP認(rèn)證。2. 建成一條年產(chǎn)100噸4AD工業(yè)化生產(chǎn)線并投入生產(chǎn)。，逐步擴大產(chǎn)能達(dá)到年產(chǎn)15噸的規(guī)模；申報EDQM注冊，填補國內(nèi)空白。4. 對地塞米松磷酸鈉系列產(chǎn)品進(jìn)行整合和改造，擴大產(chǎn)能，使地塞米松磷酸鈉達(dá)到年產(chǎn)16噸的生產(chǎn)規(guī)模；向美國FDA遞交的注冊及認(rèn)證申請，填補國內(nèi)空白。5. 建成一條年產(chǎn)20噸潑尼松龍生產(chǎn)線。7. 湖南諾凱生物醫(yī)藥有限公司成大產(chǎn)業(yè)基地建設(shè)項目本項目生產(chǎn)的產(chǎn)品為甾體激素醫(yī)藥中間體，包括雄烯二酮（簡稱4AD）、11αOH雄烯二酮（簡稱ADD）和氫化可的松（化學(xué)名11β,17α,21三羥基孕甾4烯3,20二酮），其中4AD部分作為ADD的生產(chǎn)原料，部分作為產(chǎn)品外售。產(chǎn)品方案如下：序號工程名稱產(chǎn)品名稱生產(chǎn)規(guī)模（t/a）年運行時數(shù)(h)備注14AD