【正文】 CR)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司正庚烷分析純(AR)天津市瑞金特化學(xué)品有限公司實(shí)驗(yàn)所用主要儀器如表22所示：表 22 主要儀器儀器名稱型號生產(chǎn)廠家氣相色譜儀GC2010浙江溫嶺福立儀器分析有限公司水浴振蕩器H2SH哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠電子天平BS210S北京賽多利斯天平有限公司真空干燥箱ZKF030上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司 表征方法SEM表征采用日本電子的 JSM7500F型掃描電子顯微鏡。 低溫N2吸附/脫附樣品的比表面及孔徑分布分析采用美國Micromeritics公司的 ASAP2010型自動物理吸附分析，分析前樣品在適宜溫度下抽空活化12 h，采用BET（BrunauerEmmettTeller）方法計(jì)算樣品的比表面積(SBET)BJH(BarrettJoynerHalenda)方法計(jì)算平均孔徑(Dpore)，孔體積(Vpore)。 熱重差熱 (TGDTA)分析熱重分析采用Diamond TG/DTA熱重差熱綜合分析儀，空氣氣氛流速50 mL/min，升溫速率10 K/min，最高溫度為700℃。 g載體分散在10 mL異辛烷中，加入100 L mol/L pH （PBS），攪拌均勻后靜置一段時間，10 mg假單胞菌脂肪酶（PSL）加入到上述混合液中，于30 ℃恒溫水浴搖床振蕩2小時。振蕩完畢后用砂心漏斗抽濾，濾液回收，所得固體置于真空干燥箱中在室溫下干燥后冷凍儲藏，即得到固定化酶。 mmol (R,S)1苯乙醇于10 mL正庚烷中， mmol 乙酸乙烯酯和100 mg 固定化酶，此混合物置于搖床中，于40℃、170 rpm振蕩反應(yīng)，間隔一定時間取樣（每次取150 μL），樣品由裝有手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀分析，氫火焰離子化檢測器。(R,S)1苯乙醇反應(yīng)的產(chǎn)物分析及計(jì)算 氣相色譜分析固定化酶催化拆分1苯乙醇的反應(yīng)式如圖21所示：圖21 固定化脂肪酶酶催化拆分(R, S)1苯乙醇反應(yīng)式酶促反應(yīng)完畢后，濾液由裝有手性毛細(xì)管柱(CP ChirasilDEX CB)的ShimadzuGC2010氣相色譜儀測定。色譜測試條件為：汽化室溫度250℃，柱溫108℃，檢測器溫度250℃， mL/min，分流比30:1， MPa，氫火焰檢測器(FID)。在此條件下，反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖22。圖22 1苯乙醇和產(chǎn)物乙酸苯乙酯的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖 光學(xué)產(chǎn)率的計(jì)算與一般的有機(jī)合成不同，手性合成則既要考慮化學(xué)產(chǎn)率，又要考慮光學(xué)產(chǎn)率。對映體過量可以定量描述反應(yīng)的對映體選擇性。對映體過量率是指反應(yīng)后主要對映體產(chǎn)物的過量百分?jǐn)?shù)，描述一個對映體對另一個對映體的過量率，通常用百分?jǐn)?shù)來表示，計(jì)算公式為： ， 式11上式中eeS和eeP分別表示為底物和產(chǎn)物的對映體過量值。為了對生物催化反應(yīng)有一個綜合評價，除了考慮生物催化反應(yīng)的對映體過量率外，還應(yīng)該考慮到酶催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。因此，提出了對映選擇率E的概念，產(chǎn)物和底物對映選擇率E的計(jì)算公式如下：； 式12這種用E值描述反應(yīng)的選擇性的方法主要用于消旋體拆分研究中，E值越高，即表示某一特定構(gòu)型的對映體優(yōu)先參與反應(yīng)，或者說某種特定構(gòu)型的對映體的反應(yīng)速率高于另一種構(gòu)型的對映體。一般當(dāng)E值小于15時，選擇性較差，沒有實(shí)用價值。E大于15，則具有一定的應(yīng)用價值。但E值大于100時，E值的大小受到轉(zhuǎn)化率C和對映體過量率的影響非常敏感，這一點(diǎn)需要注意[18]。設(shè)外消旋底物的起始濃度為X，反應(yīng)總轉(zhuǎn)化率為C，兩種對映體S，R的轉(zhuǎn)化率分別為CS，CR，殘留醇和生成酯的對映體過量值分別表示為eeS和eeP，則可得，或 ，根據(jù)上式，可得到 ， 式13 可見C表示為外消旋底物的總轉(zhuǎn)化率。在本實(shí)驗(yàn)中，底物(S)1苯乙醇和生成物 (R)1乙酸苯乙酯的對映體過量值(eeS, eeP) 用校正峰面積歸一法進(jìn)行分析，根據(jù)式11進(jìn)行計(jì)算。 反應(yīng)底物(R, S)1苯乙醇的轉(zhuǎn)化率(C，%)及生成物(R)1乙酸苯乙酯的對映選擇性（E）根據(jù)12和13式計(jì)算。 PSL催化拆分(R,S)1苯乙醇的機(jī)理目前脂肪酶在有機(jī)相中催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)過程已經(jīng)被公認(rèn)為是符合雙底物雙產(chǎn)物的乒乓反應(yīng)機(jī)理（PingPang 或BiBi Mechanism）。首先底物酯（A）與游離酶（E）結(jié)合形成非共價酶酯復(fù)合物(EA)，隨后該復(fù)合物經(jīng)異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為?；钢虚g體（EP）并釋放出第一個產(chǎn)物醇（P），隨后親核試劑（另一反應(yīng)物醇B）與?；福‥’）相互作用，形成另一個?；钢虚g體（E’B），它異構(gòu)化后形成另一個二元復(fù)合物（EQ），該二元復(fù)合物釋放出游離酶和新的產(chǎn)物酯（Q），整個反應(yīng)如圖所示，并且在沒有抑制條件下對于給定醇濃度得到的不同酯濃度的倒數(shù)與其相應(yīng)的反應(yīng)初速度的倒數(shù)形成一簇平行的直線[19]。許多酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的動力學(xué)研究證實(shí)了這種反應(yīng)機(jī)理，比如Zaks等[16]研究了有機(jī)相中三丁酸甘油酯與正庚醇的酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)； Rizzi等[18]研究了在正己烷中固定化脂肪酶催化乙酸乙醋與異戊醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明反應(yīng)符合乒乓反應(yīng)機(jī)理[18]。如果針對雙底物雙產(chǎn)物非對稱轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中比較復(fù)雜的情況，即兩個底物分別都具有兩個異構(gòu)體，那么任何一個異構(gòu)體的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)均為典型的乒乓反應(yīng)，而整個反應(yīng)過程是一個混合反應(yīng)機(jī)制[20]。酶(E)對底物A的兩個異構(gòu)體的選擇性由它們的反應(yīng)動力學(xué)決定，酶和異構(gòu)體結(jié)合過程為隨機(jī)過程；同樣，?；?E’)和底物B的兩個異構(gòu)體的結(jié)合過程也為隨機(jī)過程，選擇性由它們的反應(yīng)動力學(xué)決定。在實(shí)驗(yàn)得到的最適反應(yīng)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件下，固定化PSL手性拆分(R, S)1苯乙醇的不對稱反應(yīng)具有非常高的對映體選擇性(eeS和eeP均高達(dá)99%)，因此可以認(rèn)為兩個異構(gòu)體中只有一個異構(gòu)體參與反應(yīng)，另一個異構(gòu)體則可認(rèn)為不參加反應(yīng)。因此將底物A和B的兩個異構(gòu)體都視為同一底物，整體反應(yīng)就是乒乓機(jī)制。由于該反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，因此可以將反應(yīng)過程確定為一個可逆的雙底物雙產(chǎn)物乒乓反應(yīng)機(jī)制[21]。第三章 結(jié)果與討論四種活性炭N2吸附等溫線如圖31所示。1活性炭吸附等溫線的特點(diǎn)是當(dāng)p/p0=，吸附量已經(jīng)達(dá)到飽和，隨著相對壓力逐漸增大，吸附量幾乎不增加，并且脫附曲線與吸附曲線重合，無滯后回環(huán)出現(xiàn)，由此說明該活性炭中微孔占絕對優(yōu)勢。根據(jù)Polanyi位能理論，對于孔寬小于2 nm的只有數(shù)個分子層尺寸的孔，由于孔壁疊加位能的作用，孔內(nèi)吸附方式是瞬間充填而不是逐層吸附[7]。表1中1活性炭比表面積和孔體積數(shù)據(jù)也支持這一觀點(diǎn)。2活性炭最顯著特點(diǎn)是脫附線與吸附線不重合從而形成滯后回環(huán)，滯后回環(huán)閉合點(diǎn)p/p0=，對應(yīng)于孔寬2 nm的孔，表明該活性炭中存在250 nm的中孔。因?yàn)橹挥兄锌撞艜霈F(xiàn)毛細(xì)管凝結(jié)現(xiàn)象，使脫附與吸附線不重合而導(dǎo)致滯后回環(huán)的出現(xiàn)。在0p/p0，吸附線與脫附線重合，而且p/p0=%，說明該活性炭同時存在一定比例的微孔。3活性炭是介于1活性炭和2活性炭之間的過渡類型。4活性炭吸附等溫線的特征是滯后回環(huán)閉合于p/p0=，遠(yuǎn)大于中孔材料滯后回環(huán)閉合點(diǎn)p/p0=。根據(jù)BJH法，p/p0= nm，因此4樣為大孔活性炭。 1 2 圖31 活性炭吸附等溫線表31 活性炭比表面積和孔體積數(shù)據(jù)樣品BET 比表面積/m2/g孔容/cm3/g平均孔徑/nm類型微孔非微孔微孔非微孔（吸 /脫附）吸附脫附1微孔2中孔3中孔4大孔14活性炭SEM照片如圖2所示。由于煤基活性炭是由原料煤粉磨、捏合成型后經(jīng)炭化、活化工藝制成，因而顆粒結(jié)構(gòu)是煤基活性炭的共同特征，如圖32所示。由于顆粒間的孔隙寬度達(dá)到微米級，吸附時不產(chǎn)生毛細(xì)管凝結(jié)現(xiàn)象，因此通常不作為內(nèi)孔看待，而是作為外表面。圖321是典型的微孔活性炭，因此除了顆粒間的孔隙（1μm）外觀察不到任何納米尺寸的孔。圖323是過渡類型的活性炭，炭顆粒相對較1小，部分納米顆粒間形成了少量的中孔孔隙。圖322是中孔活性炭，納米顆粒間形成的孔隙以中孔為主。圖314是大孔活炭，大量的納米顆粒間形成了孔徑較為均一的50100 nm的孔。上述觀察到的現(xiàn)象與N2吸附表征結(jié)果基本一致。 1 2 3 4 圖32 活性炭SEM照片微孔，介孔，大孔活性炭，由于其孔徑大小不一，比表面積的差異性，孔結(jié)構(gòu)的不同將導(dǎo)致固定化酶在活性上也出現(xiàn)很大的差異。本實(shí)驗(yàn)則詳細(xì)地研究了活性炭的孔徑大小、比表面積及其表面基團(tuán)等對固定化PSL活性的影響[22]。表31中的數(shù)據(jù)顯示了固定在不同材料上的脂肪酶拆分1苯乙醇的催化活性。對于純的介孔分子篩載體，固定化酶的催化活性順序?yàn)槲⒖字锌酌夯裉?。因?yàn)槲絼┑目讖胶苄。久阜肿拥膭恿W(xué)直徑（5 nm）比之大的多，不能夠進(jìn)入吸附劑的孔道。因此，脂肪酶分子僅堆積在吸附劑的外表面。眾所周知，活性炭的外表面比內(nèi)表面小的多，所以，脂肪酶不能均勻地分散到活性炭表面，活力的釋放受到了束縛[23]。另外，微孔活性炭的孔徑比中孔活性炭的略小，但是微孔的活性卻比中孔的活性要略高，可能是由于微孔的孔容及比表面積比較大，并且具有三維結(jié)構(gòu)，有利于底產(chǎn)物的擴(kuò)散。對煤基活性炭001018和煤基活性炭001121來說，其孔徑比微孔活性炭和中孔活性炭的孔徑大的多，催化活性卻較弱。這個結(jié)果說明了酶分子可能進(jìn)入了它們的孔道內(nèi)部，且孔道內(nèi)非常大的比表面積使酶能夠均勻地分散，更易與底物進(jìn)行接觸，底產(chǎn)物能夠自由擴(kuò)散。根據(jù)以上一些研究，可以得出酶的催化活性與活性炭的孔徑和孔容密切相關(guān)，與比表面積無關(guān)。孔徑和孔容合適，其載體固定化酶的活性越高。表32 不同載體固定化酶催化性能催化劑eeS(%)eeP(%)C(%)E微孔活性炭001120煤基活性炭001118煤基活性炭001121中孔活性炭（吸附劑）000209中孔活性炭001066竹炭000227表32為不同載體固定化PSL拆分(R, S)1苯乙醇的催化性能，反應(yīng)條件為在