【正文】 。5）必要時(shí)，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽孢。6）用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。7）將過濾后的芽孢懸液，置無菌離心管內(nèi)，以3000 r/min 速度離心 30min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共3遍。8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶?jī)?nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。9）將芽孢液放于80℃水浴中 10min（或60℃，30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。有效使用期為半年。10）芽孢懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。11）懷疑有雜菌污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。 菌片的制備程序（1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、棉布等。根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形，大小為 10mm10mm。 當(dāng)以金屬片為載體時(shí)，因方形金屬載體在振敲時(shí)可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。（2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂方法如下：①將載體放在含洗滌劑的水中煮沸30 min；②以自來水洗凈；③用蒸餾水煮沸 10min；④用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；⑤晾干、熨平備用。（3）布片用白平紋棉布制作。在剪開前，先將脫脂的布?jí)K按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。此法制成的載體大小一致，且無毛邊。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。（4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌懸液：使用TSB營養(yǎng)肉湯配制。細(xì)菌繁殖體，可直接使用經(jīng)18h～24h培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用4℃冰箱貯存液。含菌量約為1108cfu/ml～5108cfu/ml，可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。滴染法染菌時(shí)，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片為10μl。用10μl移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個(gè)載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置37℃溫箱內(nèi)干燥（約20min～30min），或置室溫下自然陰干后再使用。（5）每個(gè)菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5105 cfu/片～5106 cfu/片。 注意事項(xiàng)（1）用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對(duì)菌懸液稀釋度的估計(jì)。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽性對(duì)照組菌懸液或菌片所含菌量），必須以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。（2）滴染時(shí)，菌液滴加量不宜過多，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。（3）細(xì)菌繁殖體在烤干過程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌在37℃干燥過程中，滴度最高可下降1個(gè)對(duì)數(shù)值。此時(shí)，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量。（4）配制菌懸液和制備菌片時(shí)，嚴(yán)格按無菌要求操作，以防污染雜菌，影響隨后殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。（5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先煮沸10min 進(jìn)行脫硫處理。（6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時(shí)放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置時(shí)間，以減少細(xì)菌的自然死亡。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 適用范圍測(cè)定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。 試驗(yàn)器材（1）刻度吸管（、）。（2）稀釋液：見附錄A。（3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A。（4）電動(dòng)混合器 操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對(duì)菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。對(duì)菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下: 取含 稀釋液無菌試管，對(duì)菌片或小型固體樣本直接投入即可，對(duì)棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上 1010103......等。（3）將菌懸液樣本在用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 101 管內(nèi)。（4）將 101 管依前法用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻， 管內(nèi)。如此類推，直至最后一管。必要時(shí)，還可作某稀釋度的1:1或1:4稀釋。（5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)每平板為 15cfu～300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 加于無菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種 3個(gè)平皿。一般需接種2個(gè)～3個(gè)不同稀釋度。平皿加樣前，應(yīng)先按組編號(hào)，以免弄混。（6）將冷至40℃～45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml～20ml。（7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)混勻，平放于臺(tái)上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。（8）每日觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。（9）對(duì)菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，先按各試驗(yàn)要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu～300cfu的平板為準(zhǔn)，每個(gè)稀釋度 3 個(gè)平板生長(zhǎng)菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該3個(gè)平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有2個(gè)符合上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的兩個(gè)平板菌落的平均值為結(jié)果。但對(duì)黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)及殺滅試驗(yàn)時(shí)，平板菌落數(shù)應(yīng)在15cfu～100cfu之間。對(duì)估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá)15時(shí)，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為cfu。 活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測(cè)定試驗(yàn)者在活菌計(jì)數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀釋度間）不宜超過10%。對(duì)誤差率的自檢，可按以下公式計(jì)算。（1）平板間誤差率計(jì)算公式：（2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式： 注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格無菌操作，防止污染。（2）認(rèn)真檢查試驗(yàn)器材有無破損（要特別注意試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。（3）注意菌液的均勻分散。（4）稀釋或取液時(shí)要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。（5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（7）傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過45℃，以防損傷細(xì)菌或真菌。傾注和搖動(dòng)時(shí)，動(dòng)作應(yīng)盡量平穩(wěn)，以利細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。（8）為提高試驗(yàn)成功率，最好先用濁度計(jì)對(duì)原菌液含菌量做出估計(jì)，盡可能在首次試驗(yàn)時(shí)所取的有限稀釋范圍內(nèi)（2個(gè)～3個(gè) 稀釋度）即有長(zhǎng)菌在 15cfu～300cfu 之間的平板。（9）結(jié)果計(jì)算時(shí)，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯(cuò)誤。 殘留消毒劑的去除方法 目 的在化學(xué)消毒試驗(yàn)中，達(dá)到規(guī)定消毒時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測(cè)出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對(duì)殺菌效果偏高的錯(cuò)誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。殘留消毒劑的去除（下簡(jiǎn)稱除藥），可排除殘留消毒劑對(duì)微生物的抑制，從而使試驗(yàn)獲得正確結(jié)果。 除藥的原則（1）可有效去除殘留的消毒劑。（2）對(duì)微生物無害，不減少微生物應(yīng)有的回收量。（3）不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度。（4）必須按規(guī)定方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，并認(rèn)為合格者方可在相應(yīng)的消毒試驗(yàn)中使用。 除藥的方法（1）化學(xué)中和法：又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。本法同時(shí)含有稀釋作用效果（至少1:1稀釋，常用1:10稀釋），是最為普遍使用的方法。對(duì)常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。所以，在消毒試驗(yàn)前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；②所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同；③即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)；④在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。（2）過濾沖洗法將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過適量稀釋，可減輕消毒劑的持續(xù)作用），并傾入裝有微孔濾膜的濾器內(nèi)，接真空泵抽吸過濾（或加壓過濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時(shí)過濾，可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗(yàn)中，如以植物提取物制備的消毒劑。本除藥方法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器；②濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理；③初次過濾后，應(yīng)使用一定量對(duì)微生物無害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)；④最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)。（3）稀釋法將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒劑濃度，以消除對(duì)微生物的抑制作用。但若稀釋過多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本法可單獨(dú)使用，但更常見的是與其它方法同時(shí)使用。單獨(dú)使用時(shí)，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。本法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間后，即時(shí)以對(duì)微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗(yàn)需要決定；②電動(dòng)混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測(cè)。 注意事項(xiàng)（1）處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，所有試液須無菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經(jīng)滅菌，以免污染樣本，影響試驗(yàn)結(jié)果。（2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以防交叉污染。此點(diǎn)由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認(rèn)真執(zhí)行，應(yīng)加以注意。（3）為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所用吸管的容量應(yīng)盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗(yàn)樣本的混勻操作，必須認(rèn)真進(jìn)行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗(yàn)微生物的接觸時(shí)間。（4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復(fù)方中的附加成份、試驗(yàn)微生物種類、消毒試驗(yàn)種類等等均有關(guān)系，試驗(yàn)條件稍有改變就可能影響除藥效果。故每進(jìn)行一種消毒試驗(yàn)（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對(duì)所選方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，合格者方可用于正式試驗(yàn)。此步驟絕不可省略，否則極有可能導(dǎo)致試驗(yàn)產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。 中和劑鑒定試驗(yàn) 目 的確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)菌和真菌殺滅試驗(yàn)。 試驗(yàn)器材（1）試驗(yàn)菌菌懸液和菌片（見 ）。（2）刻度吸管（、）。（3）小平皿（4 cm～6cm 直徑）。（4）恒溫水浴箱。（5）稀釋液：見附錄A。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見附錄A。（7）電動(dòng)混合器 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所用中和劑是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用細(xì)菌以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）在確定用何種中和劑進(jìn)行鑒定試驗(yàn)有困難時(shí)，可對(duì)多個(gè)中和劑進(jìn)行初選以確定（見本款文后【附】）。（3）試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。（4）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒劑組（第2組）無菌生長(zhǎng)，不能表明中和后受到消毒劑作用后的細(xì)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。細(xì)菌是否復(fù)蘇。此時(shí)可適當(dāng)縮短作用時(shí)間重新進(jìn)行試驗(yàn)，但作用時(shí)間最短不得少于30s，否則難以控制試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。若縮短作用時(shí)間后仍無菌生長(zhǎng)，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗(yàn)中消毒劑濃度，再次進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。（5）同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。對(duì)細(xì)菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對(duì)細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進(jìn)行。當(dāng)用其他特定微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物進(jìn)行中和劑的鑒定試驗(yàn)。（6）鑒定時(shí)根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，使用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗(yàn)?！靖健恐泻蛣┏踹x試驗(yàn)中和劑鑒定試驗(yàn)前，若難確定擬檢測(cè)的中和劑，可通過本試驗(yàn)初選，而后以選中的中和劑進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。初選操作程序如下：（1） 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。（2） 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 ，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。（3）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組。陽性對(duì)照組以 菌懸液加入含 稀釋液試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。當(dāng)3組平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)接近，如果以陽性對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)（X），前兩組長(zhǎng)菌數(shù)為（X177。50%X）以內(nèi)，可進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。 試驗(yàn)分組第1組 消毒劑 + 菌懸液 →培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力。第2組 （消毒劑 + 菌懸液） + 中和劑 → 培養(yǎng)觀察殘留消毒劑被中和后受到清毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。第3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。第4組 （消毒劑 + 中和劑）+ 菌液 → 培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖是否有影響。第5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng)作為菌數(shù)對(duì)照。第6組 稀釋液 + 中和劑 + 培養(yǎng)基 → 培養(yǎng)作為陰性對(duì)照。 中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序 根據(jù)試