【正文】 ，如螺旋藻） 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 培養(yǎng)基的種類和組成 培養(yǎng)基的種類： 孢子培養(yǎng)基 ，供制備孢子用，要求：形成大量優(yōu)質(zhì)孢子但不能引起菌株變異?；|(zhì)濃度特別是有機(jī)氮源要低些，無機(jī)鹽的濃度要適當(dāng) 菌種（種子）培養(yǎng)基 ，供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖用，營養(yǎng)成分比較豐富完整易吸收，氮源和維生素含量應(yīng)略高些。 發(fā)酵培養(yǎng)基 ，供菌體生長繁殖和合成大量代謝物，要求營養(yǎng)成分豐富完整，濃度和粘度適中。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 培養(yǎng)基的組成： 碳源：單糖（如葡萄糖、果糖）、雙糖（如蔗糖、麥芽糖）和緩慢利用的淀粉和纖維素等。其中，玉米淀粉及其水解液常用于抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制劑等的發(fā)酵；馬鈴薯、小麥、燕麥淀粉等用于有機(jī)酸、醇的發(fā)酵生產(chǎn)。有些有機(jī)酸、醇作在單細(xì)胞蛋白、氨基酸、維生素、麥角堿和某些抗生素的發(fā)酵碳源。有些石油產(chǎn)品作為微生物發(fā)酵的主要原料。 氮源：有機(jī)氮（黃豆餅、棉子餅、蛋白胨、酵母粉、魚粉等）和無機(jī)氮源（硫酸銨、氯化銨和硝酸銨等） 無機(jī)鹽和微量元素：功能為構(gòu)成原生質(zhì)體的成分（如磷硫等）、作為酶的組成成分和維持酶的活性（鎂、鐵、錳、鋅鈷等）、調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的透性（氯化鈉、氯化鉀等）和參與產(chǎn)物的生物合成等。微量因素一般有 。 生長因子：維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物等。 水：深井水、自來水和地表水 產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑：許多胞外酶的合成需要適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物存在。前提是指被菌體直接用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無顯著改變的物質(zhì)。當(dāng)前體物質(zhì)的合成是產(chǎn)物合成的限制因素時(shí)，加入前體可以增加產(chǎn)物的產(chǎn)量和在某種程度上控制生物合成的方向。加入促進(jìn)劑可刺激菌株的生長，提高發(fā)酵產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 發(fā)酵工程的一般過程： 1. 菌株的純化育種 ：菌株來源有三種途徑： a,從自然界分離篩選 。b. 從菌株保存機(jī)構(gòu)已知菌種中分離； c. 從生產(chǎn)過程中分離篩選，包括基因工程手段改造工程菌。還需要定期對菌株純化和育種。 2. 種子的擴(kuò)大培養(yǎng) ：是個(gè)逐級擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。 3. 發(fā)酵： 發(fā)酵過程的中心環(huán)節(jié)，所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備都必須滅菌，通入的空氣或中途補(bǔ)料都是無菌的，轉(zhuǎn)移種子也要常用無菌培養(yǎng)技術(shù)。 4. 下游處理 ：指發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液或生物細(xì)胞進(jìn)行分離和精制，制成符合要求的產(chǎn)品。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 發(fā)酵的方式： ? 分批發(fā)酵：營養(yǎng)物和菌種一次加入進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，中間除了空氣進(jìn)入和尾氣排除外，與外部沒有物料交換。傳統(tǒng)的生物產(chǎn)品的發(fā)酵多用此過程。除了控制溫度和 pH及通氣以外，不進(jìn)行其他控制，操作簡單。從細(xì)胞所處的環(huán)境來看，則變化明顯，發(fā)酵初期營養(yǎng)物過多，可能抑制微生物的生長，而中期又因營養(yǎng)物減少而降低培養(yǎng)效率。從細(xì)胞增殖來說，初期細(xì)胞濃度低，增長慢，后期細(xì)胞濃度雖高，但營養(yǎng)物濃度過低也長不快，總的生產(chǎn)能力不高。（畫圖表示六個(gè)時(shí)期的生長曲線：延滯期、短暫的加速期、指數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期和衰亡期），分批發(fā)酵屬于封閉系統(tǒng)。 ? 連續(xù)發(fā)酵：指以一定的速度向發(fā)酵灌內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液， 從而使發(fā)酵灌內(nèi)的液體量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)期。微生物所處的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物的濃度、產(chǎn)物濃度、 pH值等保持穩(wěn)定，微生物細(xì)胞的濃度及其比生長速率也可維持不變。甚至可根據(jù)需要調(diào)節(jié)。 ? 補(bǔ)料連續(xù)發(fā)酵：又叫半連續(xù)發(fā)酵，介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。指在微生物分批發(fā)酵中，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加一定的物料的培養(yǎng)技術(shù)。通過補(bǔ)充物料，可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時(shí)間地保持在一定范圍內(nèi)，既保證了微生物的生長需要，又不造成不利影響，從而提高了產(chǎn)率。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)（與分批發(fā)酵相比）： 優(yōu)點(diǎn)： ?維持穩(wěn)定的操作條件，利于微生物生長代謝，產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量也保持穩(wěn)定； ?更有效地實(shí)現(xiàn)機(jī)械化和自動(dòng)化，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少操作人員與病原微生物和毒性物質(zhì)接觸的機(jī)會； ?減少了設(shè)備清洗、準(zhǔn)備和滅菌等非生產(chǎn)占的時(shí)間，提高設(shè)備利用率； ?延長了儀器探頭的壽命（由于滅菌次數(shù)的減少）； ?容易對過程進(jìn)行優(yōu)化，有效提高發(fā)酵產(chǎn)率。 缺點(diǎn)： ?容易造成污染（由于系統(tǒng)開放和發(fā)酵周期長）； ?對設(shè)備、儀器及控制元器件的技術(shù)要求高； ?粘性絲狀菌菌體容易附壁上生長和在發(fā)酵液里結(jié)團(tuán)，給連續(xù)操作帶來困難。 ＃連續(xù)發(fā)酵技術(shù)目前主要用于理論研究，基本上未進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 兩種補(bǔ)料分批發(fā)酵： ?單一補(bǔ)料分批發(fā)酵，開始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，到發(fā)酵過程的適當(dāng)時(shí)期，開始補(bǔ)加碳源和（或）氮源或（和）其他必需基質(zhì)，直到發(fā)酵液的體積達(dá)到發(fā)酵灌最大操作容積后，停止補(bǔ)料，最后發(fā)酵液一次全部放出。由于受發(fā)酵灌操作容積的限制，發(fā)酵周期只能控制在較短的范圍內(nèi)； ?反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵，在單一補(bǔ)料分批發(fā)酵 的基礎(chǔ)上，每隔一定時(shí)間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，使發(fā)酵液的體積始終不超過發(fā)酵灌的最大操作容積，延長發(fā)酵周期，直至發(fā)酵產(chǎn)率明顯下降，才最終將發(fā)酵液全部放出。既保留了單一補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，又避免了它的缺點(diǎn)。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)： 補(bǔ)料分批發(fā)酵是分批發(fā)酵向連續(xù)發(fā)酵的過渡，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)，又克服了兩者的缺點(diǎn)。與分批發(fā)酵相比，首先可以解除營養(yǎng)物基質(zhì)的抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)。對于好氧發(fā)酵，可以避免分批發(fā)酵中一次性投入糖過多造成細(xì)胞大量生長，耗氧過多，導(dǎo)致通風(fēng)設(shè)備不能匹配的狀況。還可以減少菌體生長量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。與連續(xù)發(fā)酵相比，它不會產(chǎn)生菌種老化和變異的問題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣。隨著研究工作的深入和微機(jī)在發(fā)酵過程自動(dòng)控制中的應(yīng)用，補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)將日益發(fā)揮其巨大的優(yōu)勢。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 發(fā)酵工藝的控制： 溫度：最適溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝合成的溫度。隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段不同而改變。 pH值： pH值的變化取決于菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件 溶解氧濃度，發(fā)酵液的需氧量受菌體濃度、基質(zhì)種類和濃度以及培養(yǎng)條件等因素的影響，其中以菌體濃度最為明顯。 放灌時(shí)間，根據(jù)不同發(fā)酵時(shí)間所得到的產(chǎn)物產(chǎn)量計(jì)算出發(fā)酵的生產(chǎn)力和產(chǎn)品成本，采用生產(chǎn)力高而成本又低的時(shí)間作為發(fā)給時(shí)間。要考慮的指標(biāo)有產(chǎn)物的產(chǎn)量、過濾速度、氨基氮含量、菌絲形態(tài)、 pH值、發(fā)酵液的外觀和粘度等， 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 發(fā)酵設(shè)備 好氧發(fā)酵設(shè)備 機(jī)械攪拌式發(fā)酵灌 通風(fēng)攪拌式發(fā)酵灌 厭氧發(fā)酵設(shè)備 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 下游加工過程： ? 發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離 ：預(yù)處理的目的是改善發(fā)酵液的性質(zhì)，以利于固液分離（常用酸化、加熱、加絮凝劑等方法）。固液分離常用過濾、離心等方法。如目的產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還需要破碎細(xì)胞。方法有機(jī)械的（如研磨，超聲波處理，高壓均質(zhì)法，冷凍－解凍交替處理法），生物的（酶處理）和化學(xué)的（氫氧化鈉、乙酸、草酸、檸檬酸、尿素甲苯、氯仿和甲醇－鹽酸等） ? 提取 ,目的主要是濃縮，也有一定的純化作用。常用的方法有： 吸附法 離子交換法 沉淀法 萃取法 超濾法等 ? 精制 ：提取中方法也可以用于精制。大分子（蛋白質(zhì)）依賴于層析分離；小分子物質(zhì)的精制常利用結(jié)晶操作。 ? 成品加工： 根據(jù)產(chǎn)品要求，進(jìn)一步濃縮、無菌過濾、去熱原、干燥、加穩(wěn)定劑等步驟。隨著膜質(zhì)量的改進(jìn)和膜裝置性能的改善，膜技術(shù)在下游加工過程中使用越來越多。濃縮可采用升膜或降膜式的薄膜蒸發(fā)，熱敏感性物質(zhì)，可用離心膜蒸發(fā)。對大分子溶液的可用超濾膜濃縮，小分子溶液可用反滲透膜。截?cái)喾肿恿繛?10， 000的超濾膜可以除去分子量在1000以內(nèi)的產(chǎn)品中的熱原同時(shí)達(dá)到了除菌的目的。干燥方法因物料性質(zhì)、狀態(tài)及具體條件可選用真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等方法。 食 品 生 物 技 術(shù) 第四章 發(fā)酵工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 固體發(fā)酵 ：是指微生物在無游離水或幾乎沒有游離水的固體物質(zhì)上生長發(fā)酵的過程。 某些微生物生長需水很少，可以利用疏松而含有必需營養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。我國傳統(tǒng)的釀酒、制醬及天培（大豆發(fā)酵食品）的生產(chǎn)均有一個(gè)固體發(fā)酵期。固體發(fā)酵還可以用于蘑菇的生產(chǎn)、奶酪、泡菜的制作以及動(dòng)植物廢料的堆肥等。固體發(fā)酵所用原料一般為經(jīng)濟(jì)易得、富含營養(yǎng)的工農(nóng)業(yè)中的副、廢品，如麩皮、薯粉、大豆餅粉、高梁、玉米粉等。固體發(fā)酵一般都是開放的，無菌要求不高。所需設(shè)備簡單，操作容易，可因陋就簡、因地制宜。但勞動(dòng)強(qiáng)度大、不便于機(jī)械化操作、微生物品質(zhì)少，生長慢，產(chǎn)品有限等。目前主要的發(fā)酵生產(chǎn)多為液體發(fā)酵。 食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 細(xì)胞工程 ：指以細(xì)胞為單位，在體外進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖或使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意志發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)新品種，加快繁殖個(gè)體或獲得某種有用物質(zhì)的過程。 細(xì)胞工程是在細(xì)胞水平研究開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程。操作對象是細(xì)胞。 細(xì)胞工程應(yīng)包括動(dòng)植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合技術(shù)（細(xì)胞雜交技術(shù)）、核移植技術(shù)、細(xì)胞代謝物的生產(chǎn)和生物克隆等。 食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 第一節(jié) 細(xì)胞工程基礎(chǔ)知識 原核細(xì)胞 （細(xì)菌、放線菌等），外有細(xì)胞壁（由肽聚糖組成，細(xì)胞融合的主要障礙），生長迅速，是細(xì)胞改造的良好材料。 真核細(xì)胞 （酵母、動(dòng)植物細(xì)胞），植物細(xì)胞有細(xì)胞壁（由纖維素組成） 細(xì)胞工程的所有實(shí)驗(yàn)都要求在 無菌條件 下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，超凈工作臺是最基本的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，對生物材料和所用的一切器械、器皿和藥品都應(yīng)滅菌或除菌。無菌操作意識和徹底除菌是成功的一個(gè)關(guān)鍵。 食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 細(xì)胞融合：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的工程稱為細(xì)胞融合。是細(xì)胞工程的重要基礎(chǔ)技術(shù)。 細(xì)胞融合的主要過程： （除去植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁） （原生質(zhì)體）融合（ PEG， CaCI2， 或電激方法） （讓雜合細(xì)胞選擇性地長出，未融合細(xì)胞無法生長） *原生質(zhì)體 ：包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中所有內(nèi)容物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)一塊統(tǒng)稱為原生質(zhì)體。 食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 促進(jìn)細(xì)胞融合的方法（ P175） 生物學(xué)法（病毒促進(jìn)細(xì)胞融合，仙臺病毒、皰疹病毒、天花病毒等） 化學(xué)融合劑（ PEG，二甲基亞碸、甘油磷酸酯等， PEG最為廣泛） 電處理融合法（電激法，高頻電場脈沖） 食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 原生質(zhì)體融合的步驟 : (營養(yǎng)缺陷型，高滲溶液保存 ) ? 超聲波破碎法 ：很難得到完整的原生質(zhì)體球 ? 酶法 ：細(xì)菌、放線菌（ EDTA＋溶菌酶）； 革蘭氏陽性（溶菌酶）；革蘭氏陰性菌（ EDTA＋溶菌酶）。酵母（蝸牛酶， helicase）；絲狀菌（纖維素酶和纖維素酶加上蝸牛酶）；霉菌（單獨(dú)殼聚糖酶或與其它酶配合） *用對數(shù)生長期的培養(yǎng)物制備原生質(zhì)體較為合適。 *原生質(zhì)體的再生（原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后回復(fù)原來細(xì)胞形態(tài)的過程）十分重要，再生率一般為3%~10%,最高的達(dá) 50～ 80％。再生培養(yǎng)基加入牛血清蛋白，再生率幾乎可達(dá) 100％。 ： 原生質(zhì)體數(shù)＝ A－ B A—— 未經(jīng)滲透休克處理的即用高滲穩(wěn)定液作稀釋液涂布于再生平板長出的菌落，即原生質(zhì)與未去壁細(xì)胞的總和 B—— 涂布之前用低滲溶液（如水）滲透休克處理使原生質(zhì)體破裂失活后，再涂布長出的菌落，即為未破壁的菌體細(xì)胞數(shù)。 平板上再生原生 質(zhì) 板上CM融合子數(shù)融合率＝食 品 生 物 技 術(shù) 第五章 細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用 融合重組體的鑒別 直接法：融合液直接涂布于沒有補(bǔ)充兩親株生長所需要的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基的平板上，直接篩選出融合重組體； 間接法：先將融合液涂布于營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基的平板上，使未融合的親本菌株和重組的菌株都能生長，然后再用影印法接種