花生中植物螯合肽pc的研究__本科畢業(yè)論文(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-07-13 10:59:56 本頁(yè)面
【正文】 HMW，從而解除了 Cd2+的毒性。研究還發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下，液泡中的 HMW 復(fù)合物上的金屬離子還能和檸檬酸、蘋(píng)果酸相結(jié)合， 4 失去金屬離子的 PC 分解成形成氨基酸 ， 又返回細(xì)胞質(zhì)中參與 PC 的合成 。見(jiàn) 圖 圖 PC解除重金屬的毒害作用機(jī)理示意圖 5 第 1 章 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 該實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)試劑有：三氟乙酸（分析純，沈陽(yáng)新紀(jì)化學(xué)公司） ； 乙腈 (色譜純， 沈陽(yáng)新紀(jì)化學(xué)公司 )； (γ G l uCys) 4β A la(北京盛科博源生物科技有限公司 )；PC 標(biāo)準(zhǔn)品（純度 97%的丙氨酸類(lèi)植物螯合肽 PC4 )； 去離子水 ； 花生。 該實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)儀器有：配備二極管陣列檢測(cè)器 ； 色譜儀 (美國(guó)公司 )； 單極質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)公司 ) ； 有 50mm、 1 mm、 規(guī)格的 C18 色譜柱（美國(guó)公司 )，配有電霧化學(xué)源，質(zhì)譜工作站。 實(shí)方法驗(yàn) 花生樣品的處理 花生種植后，樣品被粉碎，利用索氏提取脫脂，脫脂干燥后是一種粗蛋白粉，稱(chēng) 0 . g 蛋白粉末。 花生中 PC 的提取 根據(jù) sneller（ 20xx）的方法，把花生鮮樣用液氮在研缽中磨碎，然后冷凍干燥達(dá)70 小時(shí)，冷凍干燥以后稱(chēng)量約 的花生，再加入 7mL 的 % TFA（含， PH1)，充分振蕩 30min ，然后 4 度下， 在約 10000 r/m in 離心率下離心 20 m i n ， 吸取上清液以備待測(cè)用。 巰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品的配制 選用 % TFA(含 /L 的 LDTPA) 制成 4 種巰基化合物貯備液 ，濃度均為 1mmol /L 的，分別為： Cd PC 標(biāo)準(zhǔn)品（ (美國(guó) Waters 公司）， Cys 和 GSH 備用液，置于 4℃冰箱保存 。 花生中 GSH， PC 等總含量的測(cè)定 配置含 mmol /L 的埃爾曼試劑試劑顯色劑 (含 mmol /L 的 DTPA)的 200 mmol /L 的 HEPPS 緩沖液（ pH = ），避光保存 ， 取花生組織提取液 300 L 加到 300L DTNB 顯色劑中，混勻后在 30℃下反應(yīng) 3 min，其中 GSH， PC 和 TNB 會(huì)發(fā)生反應(yīng)，生成黃色化合物，非蛋白巰基化 合物與黃色化合物含量符合 1:1 的 比例關(guān)系， 依據(jù)有差別的花生樣品在 420 nm下的吸光度值不同，便可計(jì)算出花生樣品中巰基含量。 衍生試劑 (mBBr)的配制及柱前衍生反應(yīng) 6 衍生試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，用 100%的乙腈正確配制 250mmol /L的 mBBr衍生試劑，搖勻后，置于 4℃冰箱避光保存。柱前衍生化反應(yīng)為將 10 L 25mmol/ L 的 mBBr 和 670 L 200 mmol/LHEPPS(pH = )加到 300L 的 4 種標(biāo)準(zhǔn)液和植物組織上清液中，充分混合 ， 37℃孵化反應(yīng) 40min，于 200 L 的 1 mmol/L MSA 激波旋渦抖動(dòng)，停止反應(yīng)，并作試劑空白的衍生反應(yīng)，反應(yīng)液在 4℃冰箱避光保存，等待高效液相色譜法測(cè)定。 色譜質(zhì)譜條件 （ 1） 實(shí)驗(yàn)的色譜條件 ： 選用洗脫劑為 0 .1 % 三氟乙酸 ( TFA)乙腈進(jìn)行梯度淋洗， 流速為 /min； 淋洗梯度條件見(jiàn)表 ； 設(shè)置柱溫為 30℃ ； 220280 nm的 二極管陣列檢測(cè) ； 進(jìn)樣容量為 10ml。 表 淋洗梯度 時(shí)間（ M） 三氟乙酸 (0. 1%) 乙腈 (色譜純 ) 流速（ ） 0 100 20 10 100 20 40 20 100 60 100 20 （ 2）質(zhì)譜條件 ： 柱子型號(hào)為 SB C18； 電噴霧電離的方式，噴霧電壓 ： kV； 掃描范圍是 ： m / z 6001500； 錐電壓為 ： 25 V； 采樣錐電壓： 20 V； 溶劑氣體溫度為： 360℃ ；采樣錐電壓： 20 V； 氣體溫度和溶劑： 360℃ ； 脫溶劑氣流量 ： 110m L /h。 7 第 2 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論 PCs 標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的色譜分離 經(jīng)提取的 GSH， PCs 巰基化 合物和衍生試劑 (mBBr) 在 45℃的條件下衍生反應(yīng)40min 以后，生成帶有熒光的衍物 mBSR， 在 MBSR 流線（ ACN % TFA）下，一定濃度的混合樣品的 4 種化合物和 GSH 的 分離是很清楚的，依次是 GSH ＞ PC2 ＞ PC3 ＞ PC4 這樣的分離順序 。 見(jiàn)圖 0 10 20 30 40 t/min 圖 混合樣品中標(biāo)準(zhǔn) PC， GSH化合物的色譜分離 鎘對(duì)花生體內(nèi) PC 和 GSH含量和 PCs 狀態(tài)的影響 由圖 可得到，在濃度為 60 mol/L 的 Cd 的脅迫作用下，花生體內(nèi) GSH 與未加毒的比較相比含量無(wú)有明顯差別，這是由于土壤環(huán)境中有 Fe 或者 Zn 等金屬 離子的 存在使得在無(wú) Cd 的對(duì)照組中也檢測(cè)到 了 PC2 ，通過(guò)設(shè)置多重比較，可知，花生經(jīng) Cd 處理后誘 導(dǎo)花生產(chǎn)生了 PC4，在 Cd 的影響下花生體內(nèi)產(chǎn)生的含量最大的是PC3， PC4 與 PC2 含量沒(méi)有明顯的差異。 8 圖 花生樣品中 GSH， PCs的分離色譜圖 圖 Cd脅迫下花生中 GSH， PCs的 含量 花生樣品中 PC4 的含量檢測(cè) 選擇 HPLC 質(zhì)譜
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