【正文】 可增加卵母細胞的成熟率，同時可以促進卵母細胞減數(shù)分裂和胞質(zhì)的成熟，而且有利于卵母細胞的發(fā)育和受精。 自 20 世紀 80 年代血清應(yīng)用于卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)以來，血清在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并利用，血清中含有許多成分包括能量物質(zhì)、氨基酸、維生素、激素、生長因子和細胞因子等等能夠促進原始卵泡卵母細胞生長啟動，并提供生長所需的一種或幾種因子，因而，培養(yǎng)液中添加動物血清可促進卵母細胞成熟。蔡令波等曾研究表明發(fā)情牛血清（ Estrus cows serum， ECS）較新生犢牛血清（ Newborn Calf Serum， NCS）更有利于豬卵母細胞體外成熟。 雖然血清對于豬卵母細胞的體外培養(yǎng)有較好的促進作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、維生素、細胞因子、生長因子，以及許多未知物質(zhì)，并且容易被支原體感染。因此，尋找比較適宜的血清替代品成為當前的一大研究 熱點，目前用來代替血清的替代品有牛血清白蛋白 (Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇 (Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone， PVP)等大分子有機物質(zhì)。 Naito 等 [xlv]的研究認為：在體外成熟培養(yǎng)中， PFF 可以 促進豬卵母細胞胞質(zhì)的成熟，并顯著提高豬卵母細胞受精后的原核形成率。 Vatzias 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍卵泡液在促進卵母細胞的成熟、降低多精受精方面優(yōu)于新鮮卵泡液，孟慶剛等認為在激素存在的條件下， pFF 具有促進豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟的作用。 燕 山 大 學 課 程 設(shè) 計 說 明 書 7 目前已經(jīng)證實， EGF 可以促進豬卵母細胞的核成熟。 TGFα，在結(jié)構(gòu)上和功能上與 EGF 相似，因而也可以與EGF受體結(jié)合，誘導豬卵丘細胞的擴散，促進卵母細胞核成熟。 卵母細胞的體外成熟可以為細胞核移植、轉(zhuǎn)基因等胚胎工程的研究提供大量卵母細胞。卵丘細胞與卵母細胞、卵丘擴展與卵母細胞成熟之間的關(guān)系很復雜。 卵丘細胞與卵母細胞在卵母細胞成熟過程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系 卵母細胞的發(fā)育成熟與其周圍的卵泡細胞的作用是分不開的。此時卵母細胞處于第一次減數(shù)分裂前期，以后隨著卵母細胞 開始生長，卵泡細胞迅速增殖，由單層變?yōu)槎鄬印? 卵泡細胞和卵母細胞伸出突起穿過透明帶互相聯(lián)系。壁層顆粒細胞與卵丘細胞之間，卵丘細胞與卵丘細胞之間以及卵丘細胞與卵母細胞之間，存在著廣泛的縫隙連接。處于成熟階段的卵母細胞，卵丘細胞通過大量充滿肌纖維蛋白的帶狀結(jié)構(gòu)緊密包裹著透明帶，保持 卵母細胞和卵丘細胞之間縫隙聯(lián)系，進行離子交換和一些小燕 山 大 學 課 程 設(shè) 計 說 明 書 8 的代謝物質(zhì)的交換。裸卵僅能夠利用周圍介質(zhì)中的丙酮酸和三羧循環(huán)的中間產(chǎn)物，不能直接利用葡萄糖卵丘細胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為卵母細胞的生長和發(fā)育提供能量。 卵丘細胞合成的一些蛋白質(zhì)啟動和抑制卵母細胞生長和成熟?？傊诼涯讣毎墒爝^程中，卵丘細胞對卵母細胞的發(fā)育是必需的。因而卵丘細胞對卵母細胞成熟的啟動似乎并不起主導作用，應(yīng)該只能認為是起加強或減弱的輔助作用。 盡管如此，據(jù)報道卵 母細胞成熟過程中卵丘細胞對卵母細胞受精后至囊胚的發(fā)育是必不可少的?？梢娐亚鸺毎怯绊懧涯讣毎w外成熟的重要因素之一。卵母細胞也可能通過分泌特殊因子或通過促卵泡素（ FSH）和 EGF刺激卵丘透明質(zhì)酸酶的合成，調(diào)節(jié)卵丘擴散，從而解除卵丘卵母細胞的異源連接，促使減數(shù)分裂恢復。卵丘擴展常用作判斷卵母細胞體外成熟的特征， Hunter和 Moor根據(jù)卵丘細胞擴展情況制定了牛卵母細胞體外成熟的判斷標準： 1級成熟卵為 “卵丘細胞完全擴展”；卵丘細胞團至少擴展 倍于裸卵直徑（ 300181。m）； 級成熟卵為“卵丘細胞輕度擴展”，卵丘細胞仍緊緊地粘貼在透明帶上。在小鼠，去除卵母細胞的COCs即使在含有 FSH的培養(yǎng)液中卵丘也不能擴展，說明卵丘擴展依賴于卵母細胞；但是如果在小鼠的 COCs培養(yǎng)基中加入硫酸胺 G和肝素，雖能抑制 FSH或 EGF誘 導的卵丘擴展，但對卵母細胞成熟卻無影響，說明卵母細胞成熟不一定依賴于卵丘擴展。在體內(nèi)卵丘擴展可促進精子獲能，保證正常受精和合子發(fā)育。卵丘擴展對牛卵母細胞體外成熟不是必需的。至少與細胞質(zhì)進一步成熟無直接關(guān)系。不同的研究者對卵母細胞的分類不盡一致。卵丘細胞的形態(tài)不依賴于供體的類型，擁有完整多層并且擴散的卵丘細胞的卵母細胞的比例最大（ ％～ 46％ ），其次是帶有致密多層的卵丘細胞的卵母細胞（ ％～ 28％ ），裸卵的比例小于 7％ 。 ，具有多層的卵丘細 胞（致密或分散）的卵母細胞 55％ 以上到達染色質(zhì)結(jié)構(gòu)雙線期，具有體外發(fā)育完全的最大潛力。結(jié)果證實裸卵燕 山 大 學 課 程 設(shè) 計 說 明 書 10 成熟培養(yǎng)后 CG完全消失或卵子本身形態(tài)出現(xiàn)異常。卵丘細胞已擴散成蜘蛛網(wǎng)狀的卵子成熟培養(yǎng)前后的質(zhì)成熟率均顯著高于多卵丘細胞和少卵丘細胞卵，而其受精后的發(fā)育潛力（囊胚發(fā)育率 ％ ）卻明顯不及后兩者（囊胚發(fā)育率％ 和 ％ ）。 綜上所述，在卵母細胞體外成熟過程中，卵丘細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。盡管目前卵丘擴展程度可作為卵母細胞成熟的標志之一，但卵丘擴展對卵母細胞體外成熟不是必需的。 去除卵丘細胞的卵母細胞在體外成熟過程中的超微結(jié)構(gòu)變化 去除卵丘細胞會降低小鼠卵母細胞的成熟質(zhì)量。 (1) 去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞在體外成熟過程中微絨毛由細長到短粗，由倒伏到直立均與卵丘卵母細胞復合體成熟過程中微絨毛變化規(guī)律相符。 (3) 去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞在體外成熟過程中，皮質(zhì)顆粒可能存在繼發(fā)性生成障礙或者數(shù) 量異常，該結(jié)果可能是去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞存在體外受精障礙的原因之一。盡管動物卵母細胞能夠在體外自發(fā)完成細胞核成熟，但卵母細胞成熟質(zhì)量遠不如體內(nèi)成熟卵母細胞，其受精后胚胎發(fā)育能力較差。研究表明，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)與受精率和囊胚發(fā)育率有強相關(guān)性。 盡管研究證明，卵泡細胞在卵母細胞胞質(zhì)成熟過程中起到了重要的作用，但對于不同類型細胞發(fā)揮的具體作用以及作用機制的理解還比較匱乏。因 此，本研究通過對機械裸卵和 COCs進行體外成熟，經(jīng)體外培養(yǎng)而探討卵丘細胞存在和不同形態(tài)卵 丘細胞對卵母細胞體外成熟與孤雌發(fā)育能力的影響。豬宰殺剖腹后，立即無菌剪下卵巢，挑選黃體期和紅體較少，卵泡直徑約 3~5 mm、大小均勻的 卵巢 ，使用 37 ℃ 的 PBS緩沖液 沖洗干凈 ， 置于 37 ℃ 的 PBS緩沖液 4h內(nèi)帶回實驗室。然后用帶有 18G針頭的一次性注射器，抽吸直徑 2 ~10 mm卵泡中的 卵泡液 。吸出液收集在 35 mm一次性 培養(yǎng)皿中 ，靜置 5~10 min后，在實體顯微鏡下挑選形態(tài)及顏色正常的 、細胞質(zhì)均勻的卵母細胞。 B級：卵丘細胞為 1～ 2層；或卵丘細胞雖在 3層或 3層以上，但是不完整，部分為 1～ 2層。 卵母細胞采用微滴培養(yǎng)法 .檢出的 COCS用含體積分數(shù)為 5%胎牛血清的DPBS洗滌 3次，然后用成熟培養(yǎng)液洗滌 3次，最后按實驗設(shè)計分別移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑 35mm培養(yǎng)皿中。液滴預先在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡 2h以上。 成熟培養(yǎng)液為見試驗設(shè)計 。 3. 設(shè)計 去除卵丘細胞對豬卵母細胞成熟的影響 先將包裹 3層以上卵丘細胞且包裹緊密的 COCs隨機分為 2組 ： A組 , COCs經(jīng)機械吹打 脫除卵丘細胞成為機械裸卵 (Dos)， B組 , 包裹卵丘細胞 3層以上的且包裹緊密的卵丘一卵母細胞復合體記為 (COCs)，各自單獨培養(yǎng)。探索卵丘細胞層數(shù)的多少對豬卵母細胞成熟的影響的大小。這可能是因為在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞通過與卵母細胞間的緊密縫隙連接為卵母細胞的成熟發(fā)育提供物質(zhì)和能量，促進卵母細胞發(fā)育成熟。 卵丘細胞層數(shù)對豬卵母細胞體外成熟的影響 卵母細胞周圍的卵丘細胞層數(shù)是影響卵母細胞成熟及后期胚胎發(fā)育的重要因素。 不同類型 COCs的孤雌胚胎發(fā)育能力卻不同，這可能是包 裹卵丘細胞較少的卵母細胞在體外成熟后已有老化的趨勢，卵裂后發(fā)育至囊胚的能力下降，但包裹 3層以上卵丘細胞及附帶 FSP的 COCs在體外成熟后孤雌激活時正處于發(fā)育的較佳時期，能夠很好的發(fā)育至囊胚期。 本設(shè)計重點研究了卵丘細胞在卵母細胞體外成熟過程中的作用，初步篩選燕 山 大 學 課 程 設(shè) 計 說 明 書 15 了有卵丘細胞和無卵丘細胞兩種情況下，卵母細胞中差異表達的基因，并且進一步研究卵丘細胞的不同形態(tài)對豬卵母細胞體外成熟的影響，為提高卵母細胞的 體外成熟效率提供了依據(jù)，將有助于更好的利用卵母細胞來為胚胎工程乃至克隆技術(shù)服務(wù)。這些天尋找資料，思考設(shè)計方案，穿梭于東西校區(qū)之間，不僅鍛煉了身體，也鍛煉了我們的心智，每個人都很認真的學習、準備，老師的嚴格要求是對我們最好的磨練與監(jiān)督。這一系列的過程中雖然遇到了很多的困難，但是不僅鍛煉了信息檢索的能力，計算機的熟練應(yīng)用程度，還促進了和老師、同學之間的交流，真所謂累并快樂著！ 課設(shè)的時間快要結(jié)束了，無論之前遇到了多大的困難，看到自己的成果還是滿心歡喜。最后，感謝趙紅衛(wèi)老師嚴謹?shù)膽B(tài)度和孜孜不倦的教導，他豐富的學識給了同學們很大