【正文】 列，這給高效表達(dá) 蚯蚓纖溶酶單體帶來了難度。我們實(shí)驗(yàn)室研究表明牛 βcasein信號肽有利于提高外源基 因的表達(dá)。 技術(shù)路線 方案一 ：利用蚯蚓纖溶酶 cDNA構(gòu)建載體表達(dá) 蚯蚓纖溶酶單體 1. 載體構(gòu)建： 將含牛 βcasein信號肽的 蚯蚓纖溶酶 cDNA插入 pBC1或其它載體（自己構(gòu)建的乳腺表達(dá)載體）構(gòu)建成 pBCLK載體（ ） 2. 轉(zhuǎn)基因小鼠系建立及檢測：提純 pBCLK載體，注射小鼠受精卵獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，通過 PCR和 SOUTHERN檢測轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，并對陽性母鼠進(jìn)行配種（ － 4） 3. 表達(dá)檢測：購買純化的 蚯蚓纖溶酶單體（ FII， FIII1或 FIII2），免疫家兔以獲得多克隆抗體，用這些抗體檢測重組蚯蚓纖溶酶單體在小鼠乳腺中的表達(dá)情況（ ） 4. 活性檢測：購買纖維蛋白檢測試劑盒，進(jìn)行重組蚯蚓纖溶酶的纖溶活性檢測，以 購買純化的蚯蚓纖溶酶及相關(guān)單體為對照（ ） 方案二 ：利用特異抗 纖維蛋白的單抗或單鏈片斷和蚯蚓纖溶酶 cDNA融合構(gòu)建載體表達(dá)具有 抗纖維蛋白 抗體引導(dǎo)的 蚯蚓纖溶酶單體 1. 載體構(gòu)建：將特異抗纖維蛋白的單抗或單鏈片斷 DNA（ 59D8或 MA15C5，向相關(guān)研究機(jī)構(gòu)索取或自己合成）和蚯蚓纖溶酶單體 cDNA進(jìn)行融合，并將融合序列插入 pBC1或其它載體（自己構(gòu)建的乳腺表達(dá)載體）構(gòu)建成 pBCLK載體 2. 轉(zhuǎn)基因小鼠系建立及檢測：提純 pBCLK載體，注射小鼠受精卵獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，通過 PCR和 SOUTHERN檢測轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，并對陽性母鼠進(jìn)行配種 3. 表達(dá)檢測：購買純化的 蚯蚓 纖溶酶單體（ FII， FIII1或 FIII2），免疫家兔以獲得多克隆抗體，用這些抗體檢測融合蛋白在小鼠乳腺中的表達(dá)情況；以及用抗特異抗纖維蛋白單抗的單抗（可以購買）檢測融合蛋白表達(dá)情況 4. 活性檢測：購買纖維蛋白檢測試劑盒，進(jìn)行重組蚯蚓纖溶酶的纖溶活性檢測，以 購買純化的蚯蚓纖溶酶及相關(guān)單體為對照 5. 體內(nèi)溶栓活性檢測：純化融合蛋白，對家兔進(jìn)行血栓形成實(shí)驗(yàn)之后，注射融合蛋白，檢測融合蛋白的溶栓效果以及時(shí)間。 通過 高 科技手段 對 抗 血栓 藥 進(jìn)行 不斷 地 更新?lián)Q代 ， 尋找 到 更 便宜 更 有效 的 溶栓 藥 已經(jīng) 成為 必然 。 參考文獻(xiàn)： DONG GuoQing, XiaoLing YUAN, YaJun SHAN, ZhenHu ZHAO, JiaPei CHEN, and YuWen CONG (2021),Molecular Cloning and Characterization of cDNA Encoding Fibrinolytic Enzyme3 from Earthworm Eisenia foetida. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 36(4): 303–308 Fan Qiao, Cen Wu, Li Li, Rong Fan, Cheng Wu, Quanmin Hou, Rongqiao He. (2021). Some features of intestinal absorption of intact 162。M, LJ: (1998) Fibrinolytic activity of earthworms extract (G90) on lysis of fibrin clots originated from the venous blood of patients with malignant tumors. Pat Oncol Res 3:206211. Hu Rongliang, Shoufeng Zhang, Huiying Liang, Ning Li, and Changchun Tu (2021) Codon optimization, expression, and characterization of rebinant lumbrokinase in goat milk Protein Expression and PuriWcation 37: 83–88 Il Hwan Cho, Eui Sung Choi and Hyung Hoan Lee. (2021b) Molecular Cloning, Sequencing, and Expression of a Fibrinolytic Serineprotease Gene from the Earthworm Lumbricus rubellus Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 37, No. 5, September, pp. 574581 Il Hwan Cho, Eui Sung Choi, Hun Gil Lim and Hyung Hoan Lee （ 2021a） Purification and Characterization of Six Fibrinolytic SerineProteases from Earthworm Lumbricus rubellus JBMB 37(2) pp. 199~205 Mihara, H., Sumi, H., Akazawa, K., Yoneds, T. and Mizunoto, H. (1983). Fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm. Thromb. Haemostat. 50, 258. Mihara H., H. Sumi, H. Mizumoto, T. Yoa, R. Ikeda, M. Maruyama,Oral administration of earthworm powder as a possible thrombinlytic therapy, in: K. Tanaka (Ed.), Recent Advances in Thrombosis and Fibrinolysis, Academic Press, New York, 1990, pp. 287－ 298. Mihara H, Sumi H, Yoa T et al. (1991) A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus. Jpn. . 41: 461–472. Nakajima N, Mihara H, Sumi H (1993) Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. . Biochem. 57: 1726–1730. Nakajima N, Sugimoto M, Ishihara K, Nakamura K, Hamada H （ 1999） Further characterization of earthworm serine proteases: cleavage specificity against peptide substrates and on autolysis. Biosci Biotechnol Biochem. Nov。60(Pt 5):9335. Epub 2021 Apr 21. Zhao Jing,Li Li, Cen Wu , RongQiao He, (2021) Hydrolysis of fibrinogen and plasminogen by immobilized earthworm fibrinolytic enzyme II from Eisenia fetida. International Journal of Biological Macromolecules 32 165–171 陳飛 ,孟憲志 ,李莉 ,單風(fēng)平 ,吳紅艷 ,桓明輝 , 陳杰 , 蚯蚓纖溶酶基因Ｐ 239的原核表達(dá)、純化及活性測定 微生物學(xué)雜志 .2021 24(1) 1921 段平 ,胡淑麗 ,曾耀輝 .蚯 蚓溶栓酶對大鼠凝血及纖溶指標(biāo)的影響 .時(shí)珍國藥研究 ,1997,8(1):14～ 16 姜東勝 ,張國楨 ,衛(wèi)寶珍等 . 赤子愛勝蚓纖溶酶的藥理性質(zhì)探討 .海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) ,1994 ,20 (1):16～ 19. 李洪燕，劉悅，張福榮，黃文華，李燕和陳曉光，蚯蚓纖溶酶的抗腫瘤作用，中國藥理學(xué)通報(bào)，2021， 20（ 8） 908910 龐式琪 ,丁銘臣 ,謝淑萍 ,等 .抗血栓新藥博洛克治療缺血性腦血管病的臨床觀察 .中華神經(jīng)精神科雜志 ,1993,26(4)∶ 229～ 231 王彥生 ,富成志 .雙胸蚯蚓溶栓酶對沙土鼠腦缺血再灌注腦勻 漿中ＥＴ ,ＴＸＢ 2 和 6 ｋｅｔｏ ＰＧＦ 1α的影響 .沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) ,1997,11(1)∶ 5～ 7 徐義輝 ,梁國棟 ,孫兆軍 ,陳飛 ,付士紅 ,柴玉波 ,侯云德 .2021. 蚯蚓纖溶酶新基因ＰＶ 242的克隆與表達(dá) 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展 ,2021 29(1) 601605 楊嘉樹 ,李令媛 ,茹炳根 . 蚯蚓體內(nèi)一種纖溶酶原激活劑 (e PA ) 的分離純化 [J ] . 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) ,1998 , 14(2) :156～ 163. 楊明 ,董桂華 ,張風(fēng)琴 ,等 .赤愛勝蚯蚓纖溶酶的研究 :Ⅳ .蚯蚓溶栓酶對家兔 血栓溶解及大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用研究 .生物技術(shù) ,1995,5(3)∶ 9～ 11 楊樹東，王中等 蚯蚓纖溶活性成分的抗凝及溶血栓作用，心肺血管病雜志， 1997， 16（ 3） 228230 張祖 珣 ,鐘良偉 ,鄭國平 ,等 .蚯蚓酶制劑對家兔血液流變學(xué)的影響 .山西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) ,1992,23(1)∶1～ 3