【正文】 快逸出 。 Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性 ， 能抑制細(xì)胞生長(zhǎng) ， 并通過(guò)生物膜 ， 它調(diào)節(jié) pH要依賴于溫度的變化 ， 因此不宜作為培養(yǎng)液 。 3. 生理鹽水與平衡鹽溶液 在緩沖液的基礎(chǔ)上 ， 添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類 ， 在一定程度上能滿足細(xì)胞對(duì) pH和鹽離子要求 。 對(duì)于直接接觸 、 長(zhǎng)期培養(yǎng)的培養(yǎng)液 ， 常用生理鹽水和平衡鹽溶液 ， 是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液 。 有各種不同成分的生理鹽水 ， 分別加入 pH緩沖劑與指示劑 、 葡萄糖 ， 形成平衡鹽溶液 。 BSS配制： 1） 先分別溶解 CaCl MgCl MgSO4。 3） 在另一容器中用 % NaHCO3數(shù)滴溶解酚紅 。 5） 再加入酚紅溶液 。 含葡萄糖的 BSS過(guò)濾除菌 ， 不含葡萄糖時(shí)常規(guī)高壓滅菌 。 一旦出現(xiàn)沉淀 ， 要重新配制 。 谷氨酰胺溶液中很不穩(wěn)定 ， 要單獨(dú)配制成濃縮液 。 為了優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境 ， 還添加其他成分 ， 如嘌呤和嘧啶類 ， 維生素 C、 谷胱甘肽 、 巰基乙醇 。 使用時(shí)按一定比例稀釋 ， 配制成工作液 。 單個(gè)細(xì)胞周期包括細(xì)胞間期 、 細(xì)胞分裂期 ，間期又包括間期 DNA合成期和間期 2三個(gè)時(shí)期 。 對(duì)連續(xù)細(xì)胞系，失去了細(xì)胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡。 二 、 細(xì)胞群體的生長(zhǎng)過(guò)程 細(xì)胞群體生長(zhǎng)增殖過(guò)程與微生物的生長(zhǎng)增殖過(guò)程相似 1. 潛伏期 ， 細(xì)胞經(jīng)歷一段懸浮狀態(tài) ， 貼附于器皿表面 。 細(xì)胞相互接觸匯合成片 ， 接觸抑制 ， 限制分裂和運(yùn)動(dòng) ， 密度不再增加 。 ：細(xì)胞死亡數(shù)目大于分裂數(shù)目的時(shí)期 。 這些細(xì)胞都是由受精卵分裂產(chǎn)生的細(xì)胞后代生長(zhǎng)增殖分化而來(lái) 。分化程度越高 ， 脫分化的能力越差 。 雖然成熟細(xì)胞不能再分化 ， 但其細(xì)胞核仍然具有全能性 ，因此可以通過(guò)核移植 ， 克隆動(dòng)物 。 原代培養(yǎng)： 從體內(nèi)取出的組織細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng) ， 原代培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞 ， 它生長(zhǎng)分裂并不旺盛 ， 與體內(nèi)細(xì)胞相似 ，適合于藥物檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 。 傳代細(xì)胞 : 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞 。 傳代細(xì)胞的增殖能力有限 ， 所以也稱為有限細(xì)胞系 。 根據(jù)細(xì)胞的傳代次數(shù)和壽命 ， 可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系 。 無(wú)限細(xì)胞系：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后 ， 才能變?yōu)闊o(wú)限細(xì)胞系 。 物理 、 化學(xué)或生物因素也能獲得 。 根據(jù)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)特性和對(duì)基質(zhì)的依賴性 ， 可分為貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞 。 非貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)不依賴于固體支持物表面 ， 可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng) ， 有時(shí)被稱為懸浮細(xì)胞 。 有些細(xì)胞對(duì)支持物的依賴性不嚴(yán)格 ， 可貼壁生長(zhǎng) ， 可懸浮生長(zhǎng) 。 二 、 工程細(xì)胞的獲得與保存 目前用于制藥的動(dòng)物細(xì)胞有 4類 ， 即原代細(xì)胞系 、 二倍體細(xì)胞系 、 異倍體細(xì)胞系和融合的或重組的工程細(xì)胞系 。 異倍體細(xì)胞用于產(chǎn)生重組基因工程產(chǎn)品 ， 使動(dòng)物細(xì)胞成為藥物生產(chǎn)的一個(gè)新領(lǐng)域 。 動(dòng)物組織或器官 洗滌 粉碎 酶解消化 離心或過(guò)濾 接種培養(yǎng) 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 洗 滌 37度消化 ， 檢查是否充分和完全 。 掌握好最佳時(shí)期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞 ， 過(guò)早產(chǎn)量低 ，過(guò)晚健康狀態(tài)不佳 。 要注意消化程度 ， 細(xì)胞對(duì)酶的反應(yīng)不同 ， 有的敏感 ， 掌握好適宜的消化時(shí)間和方法 ， 不要過(guò)度 ， 獲得細(xì)胞濃度均勻 ， 生長(zhǎng)速度一致的傳代細(xì)胞 。 根據(jù)藥品生產(chǎn)的有關(guān)規(guī)定 ， 必須建立原始細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)或工作細(xì)胞庫(kù) 。 低溫冷凍保存： 用冷凍保護(hù)液 （ 含 10％ 血清的培養(yǎng)液 ， 附加 10％ 甘油或%10%二甲基亞砜 ） 細(xì)胞預(yù)冷 ， 稀釋成 106細(xì)胞 /ml。 緩慢冷凍 ， 細(xì)胞放入 CO2低溫冰柜或液氮中 ， 溫度為 150— 190℃ ， 細(xì)胞的全部活動(dòng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài) 。 在保護(hù)劑存在下 ， 慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng) 。 三 、 大規(guī)模培養(yǎng)方法 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn) ， 只能采用懸浮培養(yǎng) 、 貼壁培養(yǎng) 、固定化培養(yǎng)等三種主要方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng) 。 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性 ， 貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法 。一般數(shù)天就長(zhǎng)滿整個(gè)表面 ， 形成致密的單層細(xì)胞 。 滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用 ， 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 ， 投資少 ， 重復(fù)性好 ，但勞動(dòng)強(qiáng)度大 ， 占用空間大 ， 產(chǎn)量低 ， 不易控制和監(jiān)測(cè) 。 適宜的電荷密度是粘附和貼壁的關(guān)鍵 ， 電荷密度低 ， 不能有效粘附 ， 電荷密度高則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性 。 缺點(diǎn)：操作較煩雜 ， 檢測(cè)受到一定限制 ， 培養(yǎng)條件難以均一 ， 傳質(zhì)和傳氧差 ， 放大培養(yǎng)是瓶頸 。 微載體培養(yǎng)兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn) ， 有很大的比表面積 ， 供單層細(xì)胞貼附和增殖 。 多孔微載體或多孔微球 ， 極大地增加了比表面積 ， 如Cytodex1的比表面積達(dá) 6000 cm2/g， Cytopore的比表面積達(dá) 28000 cm2/g。 玻璃珠：直徑約 2～ 3 μm， 密度 g/cm3， 難以在低速下懸浮 。 葡聚糖微載體：帶正電 ， 干粉可在 中吸脹 ， 清洗滅菌后使用 。 纖維素微載體 DE52和 DE53： 適合多種細(xì)胞培養(yǎng) 。 聚丙烯酰胺載體貼壁較快 ， 親水性 。 為了提高貼壁能力，對(duì)基質(zhì)表面進(jìn)行包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處理，可加速貼壁過(guò)程。 多孔微載體： 直徑 ～ 5 mm，孔徑 20～ 300 μm，達(dá)占總體積的 85%，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化，達(dá)到高密度培養(yǎng)。 主要用于攪拌反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器。 玻璃 、 聚苯乙烯塑料 、 不銹鋼金屬材料和微載體 、 多孔微載體或多孔微球 。 微載體有 CytodexI、 II、 III和 DEAE－纖維素等 ， 已是主要的培養(yǎng)方法 。 3. 懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程 ,主要對(duì)于非貼壁性依賴性細(xì)胞 ， 如雜交瘤細(xì)胞等 。 在懸浮培養(yǎng)中要注意發(fā)揮 動(dòng)物細(xì)胞的特性 。 方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單 ， 培養(yǎng)條件相對(duì)均一 ， 傳質(zhì)和傳氧較好 ， 容易放大培養(yǎng) 。 細(xì)胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi) ， 即細(xì)胞固定化后 ， 進(jìn)行懸浮培養(yǎng) 。細(xì)胞密度高 、 抗剪切力和污染等優(yōu)點(diǎn) ， 是生產(chǎn)首選方法 。 共價(jià)交聯(lián)：雙功能試劑處理細(xì)胞 ， 使細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法 。 網(wǎng)格型為高分子凝膠細(xì)網(wǎng)格 ， 而微囊型為高分子半透膜 。 微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi) 。 雜交瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合 ， 經(jīng)微囊發(fā)生器 ， 微球滴入氯化鈣溶液中 ， 形成凝膠 ， 然后用聚氨基酸處理 ， 使微球表面成膜 ， 再用檸檬酸去鈣離子 ， 球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài) ，細(xì)胞在在微囊內(nèi)懸浮 。 培養(yǎng)結(jié)束后 ， 收獲微囊 ， 破微囊 ， 純化抗體 ， 純化工藝簡(jiǎn)單 ， 應(yīng)用前景廣 。 （ 一 ） 分批式操作 已用于攪拌式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 ， 生產(chǎn)單克隆抗體 。 單克隆抗體的產(chǎn)量約 10～ 100 mg/L。 (二 )流加式操作 最常見(jiàn)的流加物質(zhì)是葡萄糖 、 谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì) 。 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng) ， 細(xì)胞密度可達(dá) 107， 生產(chǎn)抗體的產(chǎn)量比分批操作提高幾～ 10倍 ， 可達(dá) 500 mg/L。 （ 三 ） 半連續(xù)式操作 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用 。 半連續(xù)操作特別適用于分泌表達(dá)型細(xì)胞 ， 如雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng) ， 尤其是微載體系統(tǒng) 。 該方式操作簡(jiǎn)單 ， 使細(xì)胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平 ， 能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行持續(xù)生產(chǎn) ， 反復(fù)收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)效率高 ，是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式 。 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中 ， 比生長(zhǎng)速率比稀釋速率大 。 稀釋速率可從 0到最大生長(zhǎng)速率之間變化 ， 高稀釋速率將帶出細(xì)胞 。 連續(xù)操作的培養(yǎng)條件穩(wěn)定 ， 抗體處于最佳生產(chǎn)狀態(tài) ， 可準(zhǔn)確控制最優(yōu)化參數(shù) ， 產(chǎn)率較高 ， 但必須控制培養(yǎng)基的流加速度和液位高度 。 截留細(xì)胞方式：過(guò)濾系統(tǒng)有兩種 ， 一種是安裝在反應(yīng)器內(nèi)部或外環(huán)的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器 ， 另一種是切線過(guò)濾設(shè)備 。 流化床包埋培養(yǎng)人鼠雜交瘤細(xì)胞 ， 整個(gè)反應(yīng)器有效濃度達(dá)4 108/ml， 單位體積產(chǎn)量提高 200～ 300倍 。 2） 利用培養(yǎng)基 ， 降低細(xì)胞代謝廢物 ， 細(xì)胞生長(zhǎng)良好 。 4） 中空纖維生物反應(yīng)器 、 固定床或流化床反應(yīng)器 、 膜生物反應(yīng)器等的唯一可操作方式 。 四 、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 （ 一 ） 轉(zhuǎn)瓶 最早的大規(guī)模培養(yǎng)的反應(yīng)器 。 現(xiàn)在主要用于生產(chǎn)疫苗如流行性腮腺炎 、風(fēng)診麻疹等或用作種子罐 。 主要區(qū)別：較低的高徑比 ，滿足細(xì)胞對(duì)溶解氧的需求；低攪拌轉(zhuǎn)速 ， 大幅傾斜度槳葉或無(wú)槳 ， 避免機(jī)械傷害；圓形罐底 ， 防止細(xì)胞及載體沿體壁的沉積 。 (三 )氣升式生物反應(yīng)器 沒(méi)有攪拌裝置 ， 氣體從罐底的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流管 。剪切力小 ， 細(xì)胞的傷害小 。 適用于懸浮細(xì)胞分批培養(yǎng) ， 微載體和連續(xù)培養(yǎng) 。 通過(guò)計(jì)算機(jī)控制混合氣體的組分 ， 維持培養(yǎng)基內(nèi)的容氧和 pH值 。 抗體合成大多數(shù)處于穩(wěn)定期和衰退期 ， 不同細(xì)胞株系 ， 生產(chǎn)周期為 140－ 400h。 (四 )流化床生物反應(yīng)器 細(xì)胞固定在多孔微載體中 ， 培養(yǎng)基以適當(dāng)?shù)牧魉僮韵露辖?jīng)過(guò) ， 使多孔載體處于懸浮的流態(tài)的反應(yīng)器 。 上部微載體依靠沉降作用與培養(yǎng)基分離 ，一部分培養(yǎng)基被收集 ， 提取產(chǎn)物 ， 同時(shí)排出部分廢物；其余部分再流加等體積新培養(yǎng)基 ， 提供營(yíng)養(yǎng) ， 實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 固定床反應(yīng)器： 填料為無(wú)細(xì)胞毒性的生物兼容性可附著細(xì)胞的惰性材料 ， 可以是不銹鋼 、 玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料 。 現(xiàn)用多級(jí)流化床和多孔微球培養(yǎng) 。 接種孔 水套層 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 內(nèi)膜 外膜 腔室 細(xì)胞 培養(yǎng)基分散后 ,灌入床層 。 纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培養(yǎng)基 纖維管之間的空間組成的外室：細(xì)胞生長(zhǎng) 。 1－ 3周后可占據(jù)所有的纖維空間 ， 并在纖維外壁表面上堆積成多層 ， 細(xì)胞密度可達(dá) 108/ml。 細(xì)胞代謝的廢物是小分子物質(zhì) ， 可滲透進(jìn)入內(nèi)室 ， 從內(nèi)腔開(kāi)口排出 ， 避免了對(duì)細(xì)胞的毒性 。此時(shí)雖然細(xì)胞停止分裂 ， 但細(xì)胞的存活 、 健康和核形態(tài)不變 ， 代謝和分化功能仍可保持?jǐn)?shù)月 。 纖維素親水性強(qiáng) ， 對(duì)滲透性影響較大 ， 不適合于 Vero細(xì)胞及其他貼壁細(xì)胞培養(yǎng) 。 優(yōu)點(diǎn) :占地小 ， 產(chǎn)量和質(zhì)量高 ， 成本低 。 中空纖維反應(yīng)器是模仿了生物體內(nèi)毛細(xì)血管系統(tǒng) ， 應(yīng)用廣泛 ， 主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體 。 第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的增殖行為與培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)力學(xué) 一、動(dòng)物細(xì)胞的增殖周期 單細(xì)胞增殖周期： 細(xì)胞間期 間期 1(G1)、 DNA合成期 (S期 )、 間期 2(G2) 細(xì)胞分裂期 （ M期 ） 。 M期一般時(shí)間很短 ， 為 ～ 1小時(shí) 。 對(duì)連續(xù)細(xì)胞系 ， 失去了細(xì)胞周期控制 ， 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分會(huì)影響細(xì)胞周期 。 在培養(yǎng)過(guò)程中 ， 缺乏生長(zhǎng)因子或血清 、 營(yíng)養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生 。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的核心參數(shù)是活細(xì)胞濃度 ， 可用細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 （ μ） 、 比死亡速率 (Kd)和活細(xì)胞分?jǐn)?shù) (fv)來(lái)描述 ， 計(jì)算生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 。 oiFFdtdV?? 假定總細(xì)胞處于平衡狀態(tài)： 總細(xì)胞的積累速率 =細(xì)胞的流加速率－細(xì)胞的流出速率＋細(xì)胞生長(zhǎng)速率－細(xì)胞裂解速率。 只有活細(xì)胞才能分裂 ， 并假定活細(xì)胞不發(fā)生死亡： dlvapNkNN ?? ??μ為真實(shí)比生長(zhǎng)速率 。 Nd為死 細(xì)胞濃度 。 活細(xì)胞占主導(dǎo)，死細(xì)胞裂解可忽略，即 k l ＝ 0，那么 vapvapfNN ??? ?? )( 當(dāng)活細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗兰?xì)胞時(shí)，沒(méi)有直接改變細(xì)胞的總濃度，那么活細(xì)胞處于平衡： VNFNdtVNdvaovv ???? 0)(μa為活細(xì)胞表觀比生長(zhǎng)率： dak?? ?? 對(duì)于連續(xù)培養(yǎng)，反應(yīng)體積恒定，所以 Fi=Fo=F。表觀比生長(zhǎng)速率： DdtNdap ??)ln(?D為稀釋速率（ Fo/V） 細(xì)胞活性降低時(shí)， μ遠(yuǎn)離 μap（ D恒定）。 只有在低稀釋速率時(shí)，死亡速率才重要。 用 D=0替換前面方程 ， 可得到分批培養(yǎng)的 μap、 μ、 kd。 3． 流加培養(yǎng) 流加體積對(duì)反應(yīng)器效率影響很大時(shí) ， Fo=0， 但 Fi≠0， 所以 V不是常數(shù) 。 對(duì)于 Fi=Fo=F， V恒定的體系 ， 總細(xì)胞濃度為： NNDdtdNaps ?? ???D替換為 αsD，可得到 μap、 μ、 kd 6． 細(xì)胞裂解期 低稀釋速率的連續(xù)培養(yǎng) （ 無(wú)論細(xì)胞是否截留 ） 和分批培養(yǎng)的靜止后期和衰亡期 ， 細(xì)胞活性較低 ， 細(xì)胞裂解相當(dāng)重要 。 計(jì)量細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù) ， 必須考慮細(xì)胞裂解