質(zhì)粒dna限制性酶切圖譜分析-閱讀頁
2024-10-19 15:57本頁面
【正文】 分 DNA溶液粘在管壁上 6. 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) 7. 酶切后 DNA粘末端退火 8. 由于反應(yīng)溶液、溫度、強烈振蕩使內(nèi)切酶變性 9. 過度稀釋使酶活性降低 10. 反應(yīng)條件不適 11. 識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序 1. 用 510倍量過量消化 2. 用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 3. 同上 4. 同上 5. 反應(yīng)前離心數(shù)秒 6. 將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 7. 電泳前將樣品臵 65℃ 保溫 510分鐘，取出后臵冰浴驟冷 8. 使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強烈振蕩 9. 適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 10. 使用最佳反應(yīng)體系 11. 加大酶量 510倍 ?問題二： DNA切割不完全 原因 對 策 六、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問題分析 1. 內(nèi)切酶星狀活性 2. 其它內(nèi)切酶污染 3. 底物中含其它 DNA雜質(zhì) 1. 檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于 12%，鹽度過低， Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量 2. 用 λDNA 作底物檢查酶切結(jié)果 3. 電泳檢查 DNA，換用其它酶切，純化 DNA片段 ?問題三： DNA片段數(shù)目多于理論值 原因 對 策 六、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問題分析 1. DNA定量錯誤（如 RNA含量較高） 2. 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀 1. 用 RNA酶 A（無 DNA酶）100ug/ml消化 DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 2. 在反應(yīng)前透析 DNA樣品或用酒精沉淀二次 ?問題四：酶切后沒有觀察到 DNA片段的存在 原因 對 策 五、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問題分析 1. 保存溫度不合適 2. 以稀釋形式保存 3. 貯藏緩沖液不適當(dāng) 4. 低蛋白濃度 1. 內(nèi)切酶貯藏在含 50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在 20℃ 低溫保存 2. 稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用 3. 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 4. 內(nèi)切酶與 500ug/ml的 BSA一起保存 ?問題五：內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活 原因 對 策 五、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問題分析 1. DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì) 2. 內(nèi)切酶中含有 DNA外切酶 1. 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 2. 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 ?問題六：電泳后 DNA片段的帶型彌散，不均一 原因 對 策 五、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問題分析 1. 含磷酸鹽的濃度高 2. 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 3. 平末端連接 4. 外切酶污染 5. 連接緩沖液不合適 1. 透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 2. 延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收 DNA 3. 加大 T4 DNA Ligase用量 4. 減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收 DNA 5. 重新配制連接緩沖液 七、 DNA電泳常見問題分析 ?問題七：酶切后的 DNA片段連接效率低 原因 對 策 1. DNA降解 2. 電泳緩沖液陳舊 3. 所用電泳條件不合適 4. DNA上樣量過多 5. DNA樣含鹽過高 6. 有蛋白污染 7. DNA變性 1. 避免核酸酶污染 2. 電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低， pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響
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