【正文】 20220801 ? 首發(fā)日期： 20220513 ? 起草單位： 國(guó)家環(huán)保產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 ? 起草人： 張巖、李玉國(guó)、李揮、呂品、崔海容、周正、王麗霞、劉敬澤、郭麗敏、謝樂(lè)、劉東、閆蘊(yùn)力、李叢芬、周巍 ? 標(biāo)準(zhǔn)參照 BSEN137842022《 食品 DNA 彗星試驗(yàn)法鑒定輻照食品 篩選法 》 (英文版 )制定 ? 規(guī)定了含 DNA輻照食品的 DNA彗星試驗(yàn)篩選方法。 ? 將樣品用瓊脂糖固定在顯微鏡載玻片上后，用去垢劑裂解細(xì)胞以破壞細(xì)胞膜，然后在設(shè)定的電壓下進(jìn)行電泳。 ? 受到輻照的細(xì)胞其 DNA（含更多片段）從細(xì)胞核到陽(yáng)極的彗星比未受到輻照的細(xì)胞更長(zhǎng)一些。 ? 水平電泳儀，顯微鏡（按不同顯色方法，配置不同） 試樣制備（細(xì)胞懸液） ? 動(dòng)物組織 1 骨髓 將骨劈裂，取骨髓置在冰冷 PBS溶液中，以攪拌使細(xì)胞懸浮，過(guò)篩布（ 100 μm），待用。 ? 植物組織 1 種子、堅(jiān)果和香料 用研缽研碎去殼樣品，置于冰冷 PBS溶液中，以 500轉(zhuǎn) /分鐘攪拌。待用。 ? 裂解細(xì)胞： 使細(xì)胞膜成為可滲透膜，便于 DNA在電泳時(shí)向外遷移 ? 電泳 ? 染色 ? 檢測(cè) 對(duì)于吖啶橙染色的片子，熒光顯微鏡應(yīng)配備 460nm到 485nm（藍(lán)色激發(fā)光）的濾波片。 對(duì)于碘化丙啶或溴化乙錠染色的片子，熒光顯微鏡應(yīng)裝有 515nm到560nm（綠色激發(fā)光）的濾波片及 590nm的光柵。 對(duì)于銀染的片子，任何標(biāo)準(zhǔn)透射顯微鏡都可以觀察到。 ? 盡管大量的不同形狀或長(zhǎng)度的細(xì)胞也可能在未輻照的樣品中檢測(cè)到，但 始終有實(shí)際未損傷細(xì)胞存在這一特有的現(xiàn)象 。 ? 若用圖像分析系統(tǒng)則還可對(duì)彗星形式作客觀的評(píng)價(jià)。 其中 DEFT通過(guò)濾膜減壓過(guò)濾，在濾膜上獲得微生物，以吖啶橙熒光染色表征， DEFT值表示樣品中的微生物總數(shù)（包括輻照中死亡的微生物）。 在本方法中將由 DEFT得到的數(shù)據(jù)與 APC方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)兩者存在很大差異（ 4個(gè)數(shù)量級(jí)）時(shí)，則表明樣品可能受過(guò)輻照。 ? 局限性： 1）當(dāng)樣品中的微生物含量很少時(shí)（ APC＜ 103cfu/g） ,這種 方法會(huì)受到限制； 2）某些本身含有抑菌成分的香料（如丁香，肉桂，大蒜和芥末）會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果； 3）其他可使微生物死亡的食品加工處理方式（熏蒸，加熱處理）也會(huì)導(dǎo)致相似的 DEFT值與 APF值之差，因此，篩的陽(yáng)性結(jié)果必須進(jìn)行確證。 ? 步驟 1：檢測(cè)試驗(yàn)樣品中活的革蘭氏陰性菌（ GNB）的計(jì)數(shù)。 1℃ 的條件下，革蘭氏陰性菌在含有乳酸鏈球菌素、青霉素和結(jié)晶紫的選擇性培養(yǎng)基中好氧生長(zhǎng)， 24h177。 ? 步驟 2：采用鱟變形細(xì)胞溶解物法 (LAL)檢測(cè)鑒定試驗(yàn)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 快速、高通量篩查 適用于新鮮的整禽或胸脯、腿、翅膀等部分以及去皮或未去皮的冷藏或冷凍胴體的鑒別，適用于微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)食品的快速、高通量篩查。 3）針對(duì)碳?xì)浠衔锏臍庀嗌V檢測(cè)法 ? 原理： 在食品所含的脂肪中，脂肪酸甘油酯是主要成分，在輻照過(guò)程中，含脂樣品中已知結(jié)構(gòu)的脂肪酸（見(jiàn)表 1，表 2）經(jīng)輻照會(huì)發(fā)生化學(xué)鍵斷裂，生成少 1個(gè)碳（ Cn1，烷烴）和少 2個(gè)碳（ Cn2，烯烴）的輻照產(chǎn)物（見(jiàn)表 1，表 2），經(jīng)加熱溶出、溶劑萃取或索氏提取等方法獲得脂肪，再經(jīng)弗羅里柱萃取凈化、濃縮，以配備氫火焰檢測(cè)器或質(zhì)譜的氣相色譜儀即可檢測(cè)。 常規(guī)儀器檢測(cè)，無(wú)須特殊儀器 ； 檢測(cè)限不受樣品存儲(chǔ)時(shí)間的影響 。 4）熱釋光檢測(cè)法（ TL） ? 原理： 熱釋光檢測(cè)法是 目前國(guó)際上使用最多的法定方法， 這一方法的原理基于含有或沾染硅酸鹽粒子 (如塵埃 )的食品在輻照時(shí)，硅酸鹽粒子可吸收并穩(wěn)定能量。再將同樣的樣品經(jīng)固定劑量（通常為 1kGy）輻照處理，進(jìn)而測(cè)定其熒光，通過(guò)兩者比較便可判斷樣品是否經(jīng)過(guò)輻照。 發(fā)光曲線(xiàn) 1 發(fā)光曲線(xiàn) 2 ? 優(yōu)點(diǎn)： 方法只依賴(lài)于食品中的硅酸鹽礦物，而與食品種類(lèi)無(wú)關(guān)，且所有暴露于土壤或風(fēng)沙中的食品都不可避免的含有礦物殘?jiān)?，所以適用性廣泛。 5）光致發(fā)光檢測(cè)法（ PSL） ? 原理： 光致發(fā)光檢測(cè)法的原理與熱釋光相近，同樣利用食品中普遍存在的礦物殘?jiān)ㄈ绻杷猁}或生物無(wú)機(jī)物質(zhì)）在輻照過(guò)程中會(huì)通過(guò)束縛在結(jié)構(gòu)，空隙或雜質(zhì)中的電荷載體儲(chǔ)存能量，然后通過(guò)光刺激釋放能量，形成激發(fā)光譜。 ? 局限性 1）樣品的 PSL敏感性取決于單個(gè)樣品內(nèi)含有的礦物質(zhì)的量和類(lèi)型； 2）低礦物質(zhì)含量的甲殼類(lèi)動(dòng)物和香料需進(jìn)行校正 PSL檢測(cè)以避免假陰性； 3）樣品中鹽的存在會(huì)干擾檢測(cè)信號(hào)。 這一原理導(dǎo)致了 ESR技術(shù)在含骨，纖維素及晶體糖的輻照食品檢測(cè)中獲得廣泛應(yīng)用。魚(yú)類(lèi)的檢測(cè)限可達(dá) ，對(duì)于開(kāi)心果殼可達(dá)2kGy，辣椒粉為 5kGy，鮮草莓為 ，無(wú)花果干、芒果干、番木瓜干和葡萄干為 。 方法 名稱(chēng) 儀器（價(jià)格 / 人民幣 ） 單樣 測(cè)試所需時(shí)間 適用范圍 碳?xì)浠衔锏臍庀嗌V分析法 GC F I D （ 40 50 萬(wàn)元 ） / G C MS （ 80 100 萬(wàn)元 ） 1 2 天（視不同食品中脂肪提取的方法而定） 生肉 ，乳酪 ，新鮮鱷梨 ，木瓜 ，芒果 等食品。 E S R 光譜法 電子自旋共振光譜儀 / E S R （ 150 萬(wàn)元/ 全套，日本產(chǎn) ） 2 天（視樣品干燥的難易程度增減） 含骨的肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi) 、 開(kāi)心果殼 ；辣椒粉 ；鮮草莓 、 芒果干 、 番木瓜干 、 葡萄干 等干燥水果；檢測(cè)限取決于水果中糖的結(jié)晶度 熱釋光法 熱釋光檢測(cè)儀 / T L D （ 50 萬(wàn)元 ，美國(guó)產(chǎn) ） ；輻照源（ 40 萬(wàn)元） 4 5 天 理論上適用于幾乎所有食品，目前多用于草藥 、香料 及甲殼類(lèi)動(dòng)物 、新鮮蔬菜 、脫水蔬菜 、 馬鈴薯 。 DNA 彗星實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)輻照食品（篩選法） 常規(guī)分子生物學(xué)儀器（ 2 0 萬(wàn)以下） 2 天 肉類(lèi)（雞、鴨、鵪鶉、野雞、豬、野豬、牛、小牛、羊、鹿、魚(yú)），干果（杏仁、無(wú)花果、扁豆、大豆 ），草莓、葡萄柚、油麻、芝麻籽、向日葵種和胡椒等 。 ? 縱觀目前的輻照檢測(cè)方法，由于食品的成分復(fù)雜，不同成分對(duì)輻照的反應(yīng)存在差異，所采用的檢測(cè)方法各不相同；且方法通用性較差。 市購(gòu)新鮮豬肝、牛肝 ,以 10克 /份裝于小塑料 , 以鈷 60進(jìn)行輻照處理 ,輻照劑量分別為,每種劑量分別輻照 5個(gè)樣品，進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。浸泡在水中 12分鐘清洗載玻片。立即觀察，因干燥后會(huì)影響細(xì)胞觀察效果。鏡下DNA發(fā)紅光。橙色至黃色熒光，為樣品中活菌及處理后死亡的微生物。 計(jì)算 每克樣品中活菌及處理后死亡的細(xì)菌富集單位總和 A（ DEFT） 鏡檢計(jì)數(shù) ( 稀釋倍數(shù) 103) 樣品 名稱(chēng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A DEFT/g lgA lg(DEFT/g) 黑胡椒0kGy 18 2 9 2 7 25 30 22 20 23 2 9 26 ? 108 黑胡椒5kGy 15 16 12 20 14 1 9 22 1 6 17 21 1 .4 ? 108 黑胡椒10kGy 19 17 22 16 24 10 15 21 19 17 ? 108 計(jì)算每克樣品中活菌數(shù) B（ APC） 稀釋倍數(shù) 樣品 名稱(chēng) 101 102 103 104 105 1 06 B cfu /g lg B lg( c f u / g ) 黑胡椒0 k G y ＞ 300 ＞ 300 ＞ 300 ＞ 300 ＞ 300 ＞ 300 48 52 ? 107 黑胡椒5 k G y 98 105 11 1 4 2 0 0 0 ? 103 黑胡椒1 0 k G y 11 15 1 0 0 0 0 0 130 ? 0kGy樣品： lgA – lgB = = 該樣品為未輻照樣品。 ? 10kGy樣品： lgA – lgB = – = 該樣品為輻照樣品，應(yīng)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。 ? 鈷 60輻照得到三種試驗(yàn)樣品的 9個(gè)輻照劑量 （ 0kGy； 1kGy； ； 2kGy；； 5kGy； ； 10kGy；15kGy）。 ? 雞胸 1kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － ＝ 〈 0 該樣品為未輻照樣品。 ? 雞胸 2kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － ＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞胸 5kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － 0＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞胸 10kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － 0＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞翅 0kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － ＝ 〈 0 該樣品為未輻照樣品。 ? 雞翅 ： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － ＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞翅 ： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － 0＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞翅 ： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － 0＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。 ? 雞翅 15kGy樣品： log10 EU/g log10 cfu GNB/g＝ － 0＝ 〉 0 該樣品疑似輻照樣品，需進(jìn)一步確證。