熒光定量pcr技術(shù)講座-閱讀頁(yè)
2025-05-18 18:46本頁(yè)面
【正文】 高 CW0741 CW0743 總原則與普通 PCR相同： ? 避免引物二聚體，避免二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（ 80 – 300 bp) ? 推薦做跨 intron設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)原則 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 反應(yīng)條件優(yōu)化 內(nèi)參基因 – 目的基因 融解曲線： 單一特異性產(chǎn)物 擴(kuò)增曲線： Ct值 標(biāo)準(zhǔn)曲線： 擴(kuò)增效率盡量高，目的基因 盡可能接近內(nèi)參基因 反應(yīng)條件優(yōu)化 融解曲線分析 單一特異性產(chǎn)物 將溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo) 圖 2 Effciency slope 內(nèi)參基因 100% 目的基因 Primer 2 78% 圖 1 Effciency slope 內(nèi)參基因 100% 目的基因 Primer 1 % 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 擴(kuò)增效率盡量高 目的基因盡可能接近內(nèi)參基因 10%以內(nèi) 反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)條件優(yōu)化 擴(kuò)增曲線分析 Ct值 第一對(duì)引物ct=21 .36第二對(duì)引物ct=25 .14第一對(duì)引物第二對(duì)引物 Master Mix的應(yīng)用 熱啟動(dòng)酶 ? 化學(xué)修飾， 常溫下完全沒(méi)有聚合酶活性，熱復(fù)活需 95℃ 10分鐘 GoldStar、 HotStar ? 非化學(xué)修飾 （ Oligo修飾、抗體修飾、 Mg2+螯合物） 熱復(fù)活僅需 95℃ 幾十秒 FastStar Buffer ? 反應(yīng)增強(qiáng)劑 減少引物二聚體，進(jìn)一步提高反應(yīng)特異性 對(duì)于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率 ? 穩(wěn)定劑 dNTP Master Mix的應(yīng)用 ROX Passive Reference ? 不參與、不干擾 PCR反應(yīng) ? 恒定發(fā)射熒光信號(hào) ? 用于校正因信號(hào)檢測(cè)器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。 誤差控制 ? 使用 Master mix ? 配置預(yù)混體系 ? 設(shè)置生物學(xué)重復(fù) （不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔） ? 陰性對(duì)照 熒光定量 PCR體系 2ΔΔ Ct法 滿足條件： 1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近 正負(fù) 10% 2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率基本為 90%110% 相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析 目標(biāo)基因的 CT值 內(nèi)參基因的 CT值 待測(cè)樣本的 ΔCT 值 對(duì)照樣本的 ΔCT 值 計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 –ΔΔCT =表達(dá)量的比值 2△△ Ct 法 目的 基因 內(nèi)參 基因 目的基因 內(nèi)參基因 △ Ct 待測(cè)樣本 對(duì)照樣本 △△ Ct 倍數(shù)值 fold 2△△ Ct 對(duì)照樣本 0 1 待測(cè)樣本 Trouble shooting 常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因 解決方法 Housekeeping gene 無(wú)信號(hào) RNA降解 用新鮮組織提取 RNA Housekeeping gene 有信號(hào) 而目標(biāo)基因無(wú)信號(hào) 1. 目的基因表達(dá)低。 3. 嘗試不同 PCR引物。 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。 陰性對(duì)照在 30個(gè)循環(huán) 以內(nèi)出現(xiàn)信號(hào) 試劑被污染 1. 注意區(qū)分信號(hào)是來(lái)自引物二聚體還是 PCR產(chǎn)物 查找，替換污染試劑 2. 使用 UNG系統(tǒng)。 模板濃度進(jìn)行 10倍稀釋，稀釋 6個(gè)梯度。 – 客戶下游工作：寫論文
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