第三章核酸技術(shù)-閱讀頁(yè)
2024-11-13 14:44本頁(yè)面
【正文】 移動(dòng)距離越長(zhǎng)，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質(zhì)粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。 核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等） 三 . RNA凝膠電泳 方法：不同的 RNA電泳方法是依據(jù)使 RNA分子變性所采取的方法。 1. 乙二醛 /二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止 GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生 步驟： RNA+10mM羥甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h變性 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與 RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。 差別：有無(wú)變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中 ， 可直接用于酶促反應(yīng) （ 顏色變化 ） SDSPAGE可用于蛋白質(zhì)分子量 、 亞基組成的測(cè)定 。 五、核酸片段的分離與回收 — 用于 DNA、 RNA以及蛋白質(zhì)的回收 1) 電洗脫法 : 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中； 2) 濾紙法 — 核酸凝膠染色 長(zhǎng)波紫外光確定位置 在分離帶前方切一口子并插入濾紙條 (其背面覆蓋透析袋膜 ) 電泳至 DNA帶全部進(jìn)入濾紙條 洗脫 DNA 純化、沉淀 3) 透析袋法 — 切下含 DNA帶瓊脂塊 放入透析袋，封口 放入電泳槽 電泳 2~3小時(shí)至全部 DNA離開(kāi)凝膠塊 反向電泳 1分鐘 取出 DNA液 純化、沉淀 4) 凍融法 5) 酶解法 待回收 DNA 切口 DNA 切口 凝膠塊 濾紙法 透析袋 凝膠塊 待回收 DNA 透析袋法 待回收 DNA 凝膠塊 V型槽 電洗脫槽法 回收 DNA方法 2. 影響回收率的因素 1） DNA分子大小 — 回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)； 2）乙醇沉淀 — 其中溫度、時(shí)間和 DNA濃度（回收時(shí)體積）均與回收率有關(guān)； 3）離心時(shí)間 — 時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好，對(duì)低濃度 DNA尤其明顯。 第三節(jié) 染色體 DNA電泳 一、 DNA分子在凝膠電泳中的移動(dòng) 常規(guī)電泳 在自由電場(chǎng)中， DNA的移動(dòng)速度與分子量大小無(wú)關(guān)； 將 DNA分子置于凝膠中進(jìn)行電泳， DNA移動(dòng)距離與分子量有關(guān)。大于 20kb的 DNA大分子，其移動(dòng)距離與分子量無(wú)關(guān)。 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pulsefield gel electrophoresis， PFGE) PFG工作假說(shuō) 1) DNA松弛時(shí)間：大分子 DNA改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。這就是使不同大小分子量 DNA分離的假說(shuō)。 二 ． 脈沖場(chǎng)凝膠電泳的種類 1． 正交場(chǎng)脈沖凝膠電泳 （ OFAGE） 利用兩個(gè)或多個(gè)交變電場(chǎng) ， 使 2003000 kb的 DNA分子發(fā)生分離 ， 其電極排列可以是雙向非均勻 ， 單向非均勻等 。 一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻， 定時(shí)改變電場(chǎng)方向， DNA分子的凈 DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。常規(guī)方法制備 DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣 品增加， 制備 DNA樣品與常規(guī)方法 不同 2. 場(chǎng)倒置凝膠電泳（ FIGE） 利用常規(guī)電泳槽進(jìn)行電泳，但電場(chǎng)方向則是周期性地發(fā)生倒置，其正向和反向的脈沖時(shí)間長(zhǎng)度之比為 3或其它比值。 為了克服同移動(dòng)現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小 DNA分子一起移動(dòng)），可以采用 轉(zhuǎn)換時(shí)間遞增法 （ swichinginterval ramps） , 即由電泳開(kāi)始時(shí)的短脈沖時(shí)間逐漸遞增到電泳結(jié)束時(shí)的長(zhǎng)脈沖時(shí)間。 上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開(kāi)的大分子 DNA分離。 但讓其修復(fù)后，又可形成帶，但有的發(fā)生了重排，導(dǎo)致 帶型變化 2）非洲錐蟲(chóng)：變異表面糖蛋白基因的表達(dá) 4. 疾病的診斷 引起某種皮膚病的原生動(dòng)物 Leishmania, 具有其特征性的染色體。
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