【正文】 底物水平磷酸化 ~P ~P 機(jī)械能 (肌肉收縮 ) 滲透能 (物質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn) ) 化學(xué)能 (合成代謝 ) 電能 (生物電 ) 熱能 (維持體溫 ) 生物體內(nèi)能量的儲存和利用都以 ATP為中心 目 錄 四、線粒體內(nèi)膜選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)代謝物 線粒體基質(zhì)與胞漿之間有線粒體內(nèi) 、 外膜相隔 ， 外膜對物質(zhì)通透的選擇性不強(qiáng) ， 內(nèi)膜依賴各種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (transporter)對各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 。 一、 ADP/ATP相互轉(zhuǎn)換是調(diào)節(jié)氧化磷酸化速率的主要因素 二、甲狀腺素刺激機(jī)體耗氧量和產(chǎn)熱同時(shí)增加 ?甲狀腺激素誘導(dǎo) Na+,K+–ATP酶和解偶聯(lián)蛋白基因表達(dá)增加。 寡霉素 ATP合酶結(jié)構(gòu)模式圖 目 錄 電子傳遞鏈及氧化 磷酸化系統(tǒng)概貌： ΔμH+ 跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度 H+m內(nèi)膜基質(zhì)側(cè) H+ H+c 內(nèi)膜胞液側(cè) H+ 目 錄 四、 DNA突變影響氧化磷酸化并導(dǎo)致 多種疾病 （一）線粒體功能蛋白質(zhì)由核基因組 /線粒體基因組編碼 線粒體 DNA（ mitochondrial DNA， mtDNA）：約 17 kb, 編碼 13種重要的呼吸鏈復(fù)合體亞單位、 22種tRNA和 2種 rRNA。 目 錄 * mtDNA高突變致病原因 ： 1） 其基因不含內(nèi)含子且常有部分區(qū)域重疊 , 各種點(diǎn)突變都可能累及重要功能域； 2） mtDNA缺乏組蛋白的保護(hù)； 3） DNA合成始終活躍，但 DNA聚合酶 γ不具校讀功能，及缺乏有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)； 4）線粒體內(nèi)膜是活性氧產(chǎn)生主要部位 , mtDNA更容易受氧自由基攻擊而發(fā)生突變 , 使其突變頻率約為核基因的 10~20倍。只有當(dāng) mtDNA突變超過一定閾值 , 野生型mtDNA的數(shù)量不足維持呼吸鏈的正常功能時(shí) , 組織或器官異常才可表現(xiàn)臨床表型； ? 能量需求高的組織如骨骼肌、腦、心、腎等更易受突變影響。 ? 如 Leber 遺傳性視神經(jīng)病變（ Leber’s hereditary optic neuropathy， LHON）： 存在 mtDNA基因組的復(fù)合體 Ⅰ 亞基 4（ ND4）編碼區(qū) G11778A突變與復(fù)合體 Ⅲ 組分細(xì)胞色素 b基因的單堿基突變。 目 錄 （三）核基因突變也能造成線粒體功能障礙 ? 核基因編碼 900多種線粒體功能必需的酶和蛋白質(zhì)，除部分呼吸鏈復(fù)合體蛋白，還包括聚合酶、裝配因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶等 , 需在胞質(zhì)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)。如線粒體基因和核基因突變引起復(fù)合體缺陷，都可引起 Leigh氏綜合征。） 、 羥自由基（ 和 單線態(tài)氧（ 1O2 ） 等。 H2O2 ? H2O2不是自由基，但在細(xì)胞內(nèi) Fe2+或 Cu+的存在下可通過芬頓（ Fenton）或哈伯 韋斯（ HaberWeiss）反應(yīng)轉(zhuǎn)變成羥自由基。OH+OH175。 + H2O2 H+ O2+H2O+ 線粒體內(nèi)產(chǎn)生： （ 1） O2 （ 2） O2 （ 3）線粒體膜間隙的氧還蛋白 p66，外膜中的 Cyt b5還原酶、單胺氧化酶、二氫乳清酸脫氫酶等也可產(chǎn)生 ROS。 ； （ 2）細(xì)胞過氧化酶體中， FADH2將電子交給 O2生成 H2O2和羥自由基 、 H2O2； （ 4）巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等受炎癥刺激時(shí)可生成 O2 目 錄 Fe (Ⅱ ) Fe (III) Fe (IV) Fe (III) Fe (III) Fe (III) e CuB+ O ‖ H+ H2O 微粒體細(xì)胞色素 P450基本反應(yīng)機(jī)制 Fe (III) AH AH AH AH AH AH AOH Fe (Ⅱ ) AOH e H+ H2O2 2H+ AH O2 + 目 錄 1. SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase) 2O2 175。水平： 1010~1011 mol/L H2O2水平： 109 mol/L （二）機(jī)體抗氧化酶和抗氧化物體系清除活性氧類 目 錄 2. 過氧化氫酶 (catalase) 又稱觸酶，其輔基含 4個(gè)血紅素 3. 過氧化物酶 (peroxidase) 以血紅素為輔基，催化 H2O2直接氧化酚類或胺類化合物 2H2O2 2H2O + O2 過氧化氫酶 R + H2O2 RO + H2O RH2+ H2O2 R + 2H2O 過氧化物酶 過氧化物酶 目 錄 谷胱甘肽過氧化物酶 H2O2 (ROOH) H2O (ROH+H2O) 2G –SH G –S – S – G NADP+ NADPH+H+ 谷胱甘肽還原酶 4. 谷胱甘肽過氧化物酶（ glutathione peroxidase），它可消除 H2O2和 ROOH 目 錄 二、細(xì)胞微粒體中存在加氧酶類 （一）微粒體細(xì)胞色素 P450單加氧酶催化底物分子羥化 RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O 這類酶催化 O2中的一個(gè)氧原子加入底物 (RH)分子，另一個(gè)氧原子被 NADPH提供的氫還原成 H2O，又稱為混合功能氧化酶 (mixed function oxidase)或羥化酶 (hydroxylase)。 目 錄 目 錄 （二）加雙氧酶 (Dioxygenase)催化向底物雙鍵中加入兩個(gè)氧原子 ON H 2NHN HOC O O HN H 2C H O例 如： (O2) 色氨酸吡咯酶 目 錄 第五節(jié) 線粒體功能分析基本原理 Basic Principles of Mitochondrial Function Analyses 目 錄 一、呼吸功能和內(nèi)膜電位等指標(biāo)評價(jià)線粒體氧化還原功能 （一）線粒體呼吸功能 （二）內(nèi)膜電位水平 （三） ATP合酶亞基的表達(dá) 目 錄 ? 在一定條件下，加入線粒體后，依次定量加入反應(yīng)底物 (蘋果酸鈉 /L谷氨酸鈉 )、 ADP，用Clark氧電極法等記錄氧耗曲線，觀察線粒體呼吸態(tài)的變化。 ? 4態(tài)呼吸（ ST4）： ADP耗盡后相應(yīng)氧耗速率。 mg )，其 4態(tài)耗氧之比(ST3/ST4)表示 RCR。 2. ST4：四態(tài)呼吸時(shí)，無 ATP的合成，顯示質(zhì)子漏狀況。 * ST ST4和 RCR的意義 目 錄 測定方法及原理： 正常的親脂性的陽離子化合物能結(jié)合到線粒體內(nèi)膜。 2. 染色劑 JC1： 內(nèi)膜電位依賴性熒光染料特性，當(dāng)內(nèi)膜電位小于 100 mV時(shí)， JC1以單體存在， 490nm激發(fā)光下形成綠色熒光；內(nèi)膜電位升高時(shí)， JC1在內(nèi)膜聚集形成橙色熒光。 （三）蛋白印漬技術(shù)測定 ATP合酶亞基表達(dá) 目 錄 二、測定蛋白復(fù)合物活性反映呼吸鏈電子傳遞功能 ? 基本方法： 反應(yīng)體系中含有待測復(fù)合體相應(yīng)底物、電子受體和下游復(fù)合體抑制劑，加定量線粒體蛋白溫育。 （一）呼吸鏈蛋白復(fù)合體活性檢測顯示電子 傳遞速率 （二）蛋白印漬技術(shù)測定呼吸鏈復(fù)合體蛋白 表達(dá)