【正文】 基團 AT→ TA的顛換 喪失烷化的嘌呤 GC→ CG的顛換 糖 磷酸骨架的斷裂 巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 丫啶類 堿基之間的相互作用（雙鏈變形） 碼組移動（＋或－） 紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→ AT轉(zhuǎn)換 形成嘧啶的二聚體 碼組移動（＋或－） 交 聯(lián) 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 DNA降解 碼組移動（＋或－） 糖 磷酸骨架的斷裂 巨大損傷 （缺失、重復(fù)、倒位、易位） 加熱 C脫氨基 CG→ TA轉(zhuǎn)換 Mu噬菌體 結(jié)合到一個基因中間 碼組移動 紫外輻射誘變作用機制 微生物的變異 紫外輻射的生物學(xué)效應(yīng)主要是引起 DNA的變化 。 嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多，其光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物主要是嘧啶二聚體和水合物，相鄰嘧啶形成二聚體后造成局部 DNA分子無法配對，從而引起微生物的死亡或突變。它作為許多不同類型的 DNA損傷修復(fù)的普遍系統(tǒng)，如嘧啶二聚體和錯誤堿基配對引起的 DNA損傷。 uvrABC內(nèi)切核酸酶在損傷的任何一邊作一切口，聚合酶 I切除和替換損傷部位的堿基， DNA連接酶將缺口填補上。 DNA聚合酶 以另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’OH端起合成缺失片段。 重組修復(fù) (復(fù)制后修復(fù) ) 胸腺嘧啶二聚體不能被復(fù)制，不是在此位點阻塞，而是 DNA聚合酶能跳過該損傷部位，沿著下面 DNA的模板，恢復(fù) DNA繼續(xù)合成。由于需要一個完整的鏈作為模板，不能用切補修復(fù)來恢復(fù)。母鏈 DNA在二聚體的對面應(yīng)當(dāng)含有完整的序列。 ? 細(xì)胞在不切除二聚體的情況下，以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補單鏈，但在每個二聚體附近留有一空隙。 SOS修復(fù)系統(tǒng) 細(xì)胞中有許多基因和操縱子受 RecA蛋白協(xié)同調(diào)控和LexA蛋白阻遏轉(zhuǎn)錄。為一個傾向差錯的修復(fù)系統(tǒng)，該系統(tǒng)與 DNA聚合酶相互作用，使之通過嘧啶二聚體繼續(xù)復(fù)制 DNA。 SOS— 修復(fù)系統(tǒng)是由 RecA蛋白誘導(dǎo)的，由于存在 DNA損傷， RecA蛋白構(gòu)型改變顯示出激活態(tài)。只要細(xì)胞中存在 DNA的損傷， SOS修復(fù)系統(tǒng)的基因就能表達。 微生物的變異 突變與育種 ? 定向培育和馴化 定向培育是指用某一特定因素長期處理某一微生物培養(yǎng)物，同時不斷對它們進行傳代，以達到累積并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。 環(huán)境工程仍采用定向培育的方法培育菌種，也稱為馴化。 誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而增加產(chǎn)品的產(chǎn)量外，而且還可達到改進產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等目的，故仍是目前使用最廣泛的育種手段之一。 微生物中各種基因重組形式的比較 整套染色體 局部雜合 高頻率 低頻率 部分染色體 個別或少數(shù)基因 細(xì)胞融合或連接 性細(xì)胞 真菌的有 性生殖 體細(xì)胞 真菌的準(zhǔn)性 生殖 細(xì)胞間暫時溝通 細(xì)菌的結(jié)合 性導(dǎo) 細(xì)胞間不接觸 吸收游離DNA片段 轉(zhuǎn)化 噬菌體攜帶 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo) 由噬菌體提供遺傳物質(zhì) 完整噬菌體 溶原轉(zhuǎn)變 噬菌體DNA 轉(zhuǎn)染 基因重組 ? 重組是分子水平上的概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交，而一般所說的雜交是細(xì)胞水平上的概念。 真核微生物中的有性雜交，準(zhǔn)性生殖以及原核微生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和溶原轉(zhuǎn)變等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映 。 有性雜交：一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。它可使同一生物的兩個不同來源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。 ? 只有處于感受態(tài)的細(xì)胞才能接受轉(zhuǎn)化因子，進行轉(zhuǎn)化作用。 ? 轉(zhuǎn)化現(xiàn)象是在 1928年由 Griffith進行肺炎雙球菌的研究中發(fā)現(xiàn)的。 基因重組 二、轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)化過程： 感受態(tài)細(xì)胞的出現(xiàn) DNA的吸附 DNA進入細(xì)胞 DNA解鏈，形成受體 DNA－供體 DNA復(fù)合物 DNA復(fù)制分離 基因重組 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transfection） ? 轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象由 ， 以后又在許多原核微生物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn) 。 由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細(xì)胞 ， 稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)子 。 它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為 10－ 5～ 10－ 8。 溶源轉(zhuǎn)變 ? 溶源轉(zhuǎn)變 (lysogenic conversion)：是一種與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，但本質(zhì)上卻不相同的特殊現(xiàn)象，即當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主后，發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。 ? 溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的。 突變體的檢測與篩選 一 、 突變體的檢測 ?直接檢測表現(xiàn)型 菌落 、 影印平板法等 ?間接檢測法 通過控制培養(yǎng)條件獲得 ， 如 Ames試驗 。 要獲得預(yù)定的效應(yīng)表型主要靠科學(xué)的篩選方案和篩選方法 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 遺傳工程是從分子遺傳學(xué) ,特別是從細(xì)菌質(zhì)粒和限制性酶等研究中發(fā)展起來的一個分子遺傳學(xué)的分支學(xué)科 。 ? 遺傳工程可分為狹義和廣義兩種 。 習(xí)慣上所說的遺傳工程多指基因工程 。 質(zhì)粒育種 質(zhì)粒：染色體外 DNA，游離于原核生物染色體外 ,具有獨立復(fù)制能力的小型共價閉合環(huán)狀 DNA分子，在細(xì)胞分裂過程中能復(fù)制將遺傳性狀傳給后代。 ? 外界因素可使質(zhì)粒發(fā)生丟失或轉(zhuǎn)移，喪失由該質(zhì)粒決定的某些性狀，但菌體不死亡。 ? 質(zhì)粒有重組功能。 ? R因子：對多種抗生素表現(xiàn)抗性 ? Col因子：控制大腸桿菌素產(chǎn)生 ? 降解性質(zhì)粒：假單胞菌中發(fā)現(xiàn)，可編碼一系列可降解能降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，從而能利用細(xì)菌難以利用的物質(zhì)做 C源。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 基因工程特點 ? 打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制。 ? 可創(chuàng)造自然界原來沒有的生物。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 目的基因的取得 途徑有 3種： ? 選擇適宜的供體細(xì)胞，以便從中采集分離到有生產(chǎn)意義的目的基因； ? 通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由 mRNA合成 cDNA(互補 DNA)； ? 用化學(xué)方法合成特定功能的基因。 目前原核受體細(xì)胞的載體主要有細(xì)菌質(zhì)粒 (松弛型 )和 λ 噬菌體兩類。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 目的基因與載體 DNA的體外重組 對目的基因與載體 DNA均采用限制性內(nèi)切酶處理 ， 從而獲得互補粘性末端或人工合成粘性末端 。 由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈 DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸組分 ， 所以當(dāng)兩者相混時 ， 凡粘性末端上堿基互補的片段 ， 就會因氫鍵的作用而彼此吸引 ， 重新形成雙鏈 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 重組載體引入受體細(xì)胞 體外反應(yīng)生成的重組載體只有將其引入受體細(xì)胞后 ， 才能使其基因擴增和表達 。 把重組載體 DNA分子引入受體細(xì)胞的方法很多 。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù) 在 1983年，美國 Cetus公司 人類遺傳研究室的科學(xué)家 .發(fā)明的。 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 (c) (b) 引物 2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶 DNA的擴增 (a) 5’ 3’ 引物 1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物 2互補鏈 引物 1互補鏈 單位長度的鏈 不同長度的鏈 5’ 3’ 3’ 5’ 引物 1互補鏈 引物 2互補鏈 目的片段（不同長度的鏈未示出） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖 (e) (f) (g) 分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護中的應(yīng)用 PCR操作步驟