基因工程操作的工具酶-閱讀頁(yè)
2025-01-21 02:22本頁(yè)面
【正文】 DNA聚合酶 分為兩類： ①依賴于 DNA的 DNA聚合酶，包括大腸桿菌DNA聚合酶 I（全酶）、大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 Klenow大片段酶、 T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高溫的 DNA聚合酶等。 DNA聚合酶 (1)大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ DNA pol I)： 也稱為 Kronberg酶，是 Kronberg等 1956年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè) DNA聚合酶。 c、 5’ 3’外切酶活性 CGCATTAG DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC (2).Klenow酶：也稱 DNA聚合酶 I大片段，Klenow片段或 K1enow聚合酶。 具有 5’—3’聚合酶活性； 3’—5’外切酶活性。 主要用途是進(jìn)行 PCR反應(yīng)。 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的最適溫度為 41～ 45℃ ，最適 pH為 。 ? 外切酶活性比 Klenow酶高 100～ 1 000倍。 T7噬菌體 DNA聚合酶 ? 持續(xù)合成能力最強(qiáng)的酶。 4. DNA連接酶 1967年發(fā)現(xiàn)。 DNA ligase. Ecoli和其他細(xì)菌：能源（ NAD+). 動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體：能源（ ATP). 連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的 DNA分子。 (2). DNA連接酶 不能連接平端 DNA,不能連接 RNA。l T T:4 15 ℃ , 4 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下 ,15 ℃ 反應(yīng) 1 小時(shí)，完全連接 1 181。 5’pDNA 5’OHDNA 5’pRNA 5’OHRNA 分類： （ 1） BAP(bacterial alkaline phosphatase） :細(xì)菌堿性磷酸酶，來(lái)源于大腸桿菌 。 （ 2） CIP（ calf intestinal alkaline phosphatase ） :牛小腸堿性磷酸酶，來(lái)源于小牛腸 。 堿性磷酸酶的主要用途有： （ 1） 5’末端標(biāo)記前的處理； （ 2）去除 DNA片段的 5’磷酸基團(tuán)，防止自身連接； 分子量 60000D,在二價(jià)陽(yáng)離子的作用下，催化 dNTP加于 DNA分子的 3’羥基端。 用途： cDNA加同聚尾。 S1 S1 核酸酶的基本特性：來(lái)自稻谷曲霉菌（ Aspergillus oryzae） 水解單鏈核酸以及雙鏈核酸中的單鏈區(qū)或單鏈末端 ，產(chǎn)生 5’–核苷酸和 5’末端為 p的寡核苷酸 。 S1核酸酶 降解單鏈 DNA或 RNA,產(chǎn)生帶 5’磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。 用途： (1) 去除 DNA片斷中突出的單鏈尾以產(chǎn)生平端。 帶切口的雙鏈 DNA S1核酸酶 8 .T4噬菌體多核苷酸激酶 催化 ATP的 γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到 DNA或 RNA的 5’末端。已在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了多核苷酸激酶。 5’磷酸基團(tuán)的 DNA進(jìn)行磷酸化或者合成接頭進(jìn)行磷酸化。 酶反應(yīng)的最適 pH在 7左右 ， Mg2+、 Mn 2+和 Co2+是激活劑 。 舉例：5’pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3’ 5’pApGpCp＋ ? 5’pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3’ 5’pApGpCp＋ Cp ＋ GpApApUp ＋ GpCp ＋ ApG RNaseU2 RNaseU2的堿基專一性與 RNase A互補(bǔ)，特異水解 RNA鏈中嘌呤核苷酸的 3’磷酸基團(tuán)與相鄰核苷酸的 5’OH之間的鍵，生成以 3’嘌呤核苷酸和以 3’嘌呤核苷酸為末端的寡核苷酸。特異作用于鳥(niǎo)嘌呤核苷酸3’端磷酸并切斷相連的磷酸二酯鍵。 3 Eco RⅠ 的識(shí)別切割序列是： 。 5 濃縮的酶液可以用水稀釋。（ ） 7 依賴于 RNA的 DNA聚合酶是 。 9 能夠在 DNA分子的 3’羥基端加 dNTP的酶是
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