【正文】 ligase所連接 。 常用 DNA ligase 來(lái)源 ? 由大腸桿菌染色體編碼的叫 DNA連接酶 ，即 DNA ligase， 以 NAD+為輔因子 由大腸桿菌 T4噬菌體編碼的叫T4 DNA連接酶，以 ATP為輔因子 ?基因工程中常用的連接酶主要有 ： T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶 ，而以前者為最常用。 5180。 5180。 5180。 5180。 ? 粘性末端 DNA片斷之間的連接，酶濃度 。 ?如果待連接的 DNA片斷的末端是用同一限制酶酶切所得，則連接后仍保留原限制酶的識(shí)別序列，如果是用兩種限制酶酶切所得，則重組DNA分子往往會(huì)失去原限制酶的識(shí)別序列， （ 1）具有互補(bǔ)粘性末端片斷之間的連接 ? 具粘性末端的載體易發(fā)生自連（防止方法）： ? 對(duì)載體的 5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的 堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連 。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體 DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去 5’P的鏈不能進(jìn)行連接， 形成3’ OH 和 5’ OH 的缺口 。 堿性磷酸酯酶 堿性磷酸酯酶： 是催化從單鏈或雙鏈 DNA和 RNA分子中除去 5′ 磷酸基，即脫磷酸作用。 兩種酶反應(yīng)均需要 Zn2+。 ?主要用途： 去除 DNA和 RNA的 5′ 磷酸基，產(chǎn)生 5′ 羥基末端，然后在 T4多聚核苷酸激酶催化下，用 [α 32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，繼而進(jìn)行序列分析； 去除載體 DNA兩末端的 5′ 磷酸基，防止載體DNA自我環(huán)化，提高 DNA重組率。 （ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 ?連接平末端 DNA的方法除直接利用 T4 DNA ligase外，還可以用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。 ?末端轉(zhuǎn)移酶可給一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dA或 dG；另一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dT或 dC，混合這些分子，即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。 3180。 ?同聚物尾巴有 poly（ dA）與 poly（ dT）、 poly（ dC）與 poly（ dG）。 銜接物 是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個(gè)核苷酸，其 結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu) 。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 DNA接頭（ adapter）連接法 ?DNA接頭（ adapter）：它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷 。對(duì) DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。 ? 熱穩(wěn)定的 DNA連接酶從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來(lái)的，能在高溫（ 85~94℃ ）下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 ? （ 2）連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ LCR）：也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)，用寡核苷酸探針通過 DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶 DNA的方法。 樣品 DNA、探針 (4) 94度變性 三 .DNA聚合酶 ?DNA聚合酶 ?分子生物學(xué)中常用的 DNA聚合酶 ?大腸桿菌 DNA聚合酶 (DNApolymerase) ?DNA聚合酶 :指在 DNA(或 RNA)模板指導(dǎo)下，以 4種脫氧核糖核苷酸（ dNTP）為底物，在引物 3’ OH末端聚合 DNA鏈的一類酶。 ① 需模板 (DNA或 RNA)； ②需引物； ③具有三種酶活性，即 5′→3′ 聚合酶活性； 5′→3′ 外切酶活性和3′→5′ 外切外切酶活性。 ?共同點(diǎn)：把 脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈 DNA分子引物鏈的 3’OH末端 ，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ｉ ?1957年，美國(guó)的生物學(xué)家在大腸桿菌提取物中存在 DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的 DNA聚合酶Ｉ (全酶 )。 DNA聚合酶Ｉ的酶活性 ?5’ → 3’的聚合酶活性； ?5’ → 3’的外切酶活性； ?3’ → 5’的外切酶活性（較低）。 1） 5′→3′ 聚合酶活性： CCG GGCTATCGG DNApolI Mg 2+， 4dNTP CCGATAGCC GGCTATCGG 2） 5′→3′ 外切酶活性 3） 3′→5′ 外切酶活性 GATAGCC AGCTATCGG TCGATAGCC AGCTATCGG DNApolI Mg 2+ + pC， pT 5′ TCGATAGCC AGCTAT DNApolI Mg 2+ TCGATA AGCTAT + pC， pG， pC 5′ DNA聚合酶的三種活性 ? DNA polⅠ 的 5‘→ 3’聚合活性和 5‘→ 3’外切酶活性協(xié)同作用 ， 可以使 DNA一條鏈上的切口從5‘→ 3’方向移動(dòng) ， 這種反應(yīng)叫做 缺刻平移 (nick translation)。 DNA聚合酶 Ⅰ 在 DNA復(fù)制過程中的作用 DNA聚合酶Ⅰ在DNA復(fù)制過程中的作用 DNA的切口平移（ nick translation） DNA聚合酶 Ⅰ 在分子克隆中的主要用途是通過 DNA缺口平移 ， 制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針 。 ?標(biāo)記物：探針上結(jié)合有易被檢測(cè)的化合物稱為標(biāo)記物 。 商品上用的此酶來(lái)源于 Phage NM964整合的溶源性 。 ? 活性 5′→ 3′聚合 ， 3′→ 5′和 5′→ 3′外切 。 這種標(biāo)記也稱作交換標(biāo)記 ， 但 Klenow作用不如T4DNA聚合酶 。 （ 同 Klenow） ?3′ 粘性末端的標(biāo)記制備 DNA探針 ,同 Klenow 末端標(biāo)記 。 故在 DNA測(cè)序中很優(yōu)越 。 ?用途 ?復(fù)制較長(zhǎng)的模板，在測(cè)序中可讀出較長(zhǎng)的序列 ?用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。 ?定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。 用還原劑 、 分子氧 、 低濃度 Fe２ +與酶保溫幾天 ，可使 PhageT7 gene5蛋白 N端 3′ → 5′ 外切酶活性中心失活 (O 修飾 )。 3′ → 5′ 外切作用下降 99%以上 。 ? 活性：聚合最適溫度為 7580℃ ， 不具 3′ → 5′外切酶活性 ， 具 5′ → 3′ 外切活性 。 ?測(cè)序， 高溫 下進(jìn)行 DNA合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。 ? 1970年， DNA聚合酶 Ⅱ ，分子量 120KDa。 ? DNA聚合酶 Ⅲ 由多個(gè)亞基組成（ αεζδβ） ? 特點(diǎn)： ? 5’ → 3’的聚合酶活性；作用于雙鏈 DNA分子中有空隙（ gap）的單鏈 ? 3’ → 5’的外切酶活性 ? 5’ → 3’的外切酶活性； DNA聚合酶 Ⅲ 反轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase） ?來(lái)源 ：商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種 ?來(lái)自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒 (AMV)。 ?結(jié)構(gòu)和活性 ： 酶類別 肽鏈 5’3’聚合活性 RNAseH AMV α 62， 000 β 94， 000 + +++ MMLV 84， 000 + + ?用途： (1) 5’ 3’ 聚合酶活性 , 能以 RNA或 DNA模板合成 DNA分子； (2) RNA酶 H活性 ， 對(duì) RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解 ， 免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用 NaOH降解 RNA模板的步驟 。磷酸基和 3180。末端 Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無(wú) 5??3?外切活性。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。 ? 3DNA分子的體外連接方法有哪些