[理化生]12基因工程基本操作程序-閱讀頁
2025-01-18 23:50本頁面
【正文】 A探針置沸水浴 10min，迅速置冰上冷卻 12min，使 DNA變性成 單鏈 。雜交是在相對高離子強(qiáng)度的緩沖鹽溶液中進(jìn)行也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。 主要應(yīng)用 (3)用化學(xué)方法直接 人工合成目的基因 蛋白質(zhì)氨基酸序列 → mRNA的核苷酸 序列 → 目 的基因序列 → 目的基因 針對：基因比較小，核苷酸序列又已知 推測 化學(xué)合成 思考： 不具有，缺少非編碼區(qū) (啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。 ② 同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。 質(zhì)粒 DNA分子 限制酶處理 一個切口 兩個黏性末端 兩個切口 獲得目的基因 DNA連接酶 重組 DNA分子（重組質(zhì)粒） 同一種 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 2022/1/4 22 尋根問底： 將生物的所有 DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？ 有人采用總 DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總 DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)胞，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。此法目前爭議頗多，嚴(yán)格來說不算基因工程。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因 啟動子 ，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。 資料證明：載體構(gòu)建組成要完整 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ： 目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的工程 ： ① 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。 ② 花粉管通道法 （ 3） 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 — 感受態(tài)細(xì)胞法。 ①特點 : 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法： （ 1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 能感染 雙子葉植物 和 祼子植物 ,對 大多數(shù)單子葉植物 沒有 感染能力 ② 過程 ： ③ 適用生物： 雙子葉植物 、 祼子植物 。 ③ 適用：單子葉植物 ①細(xì)胞類型： ②操作程序 ： ___顯微注射法： （ 2） 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 發(fā)育成新性狀動物 移植到子宮或輸卵管 培養(yǎng)成早期胚胎 顯微注射 取受精卵（體內(nèi)或體外 受精） 提純含目的基因表達(dá)載體 受精卵 ③ 常用法： ②常用菌： ① 微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少 ④過程： 大腸桿菌 Ca2+處理 獲得感受態(tài)細(xì)胞 Ca2+處理 大腸桿菌 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 表達(dá)載體 與感受態(tài) 細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞 吸收 DNA ___感受態(tài)細(xì)胞法 （ 3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 例： 若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？ 答：不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含這兩種細(xì)胞器。 四 目的基因的檢測與鑒定 —— 檢查是否成功 導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組 DNA分子嗎？ 真正能攝入重組 DNA分子的受體細(xì)胞很少。 變性 方法： DNA分子雜交（ northern雜交） （ 2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA 探針 15N 15N 轉(zhuǎn)基因生物 的 mRNA 14N 14N 如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。 受體細(xì)胞攝入 DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？ 若不能表達(dá)，要對抗蟲基因再進(jìn)行 修飾 。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)
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