實驗二蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)及蛋白質(zhì)含量測定-閱讀頁
2025-06-02 22:03本頁面
【正文】 酸的羧基。缺點：不能滴定多種氨基酸的混合物、不能滴定 pro、 ：可確定蛋白質(zhì)的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加。 – 考馬斯亮藍 G250溶于醇和熱水，微溶于冷水；考馬斯亮藍又稱弱酸性艷藍 6B，酸性條件下為紅色，配成的貯備液是 綠色 ，但調(diào)整溶液的酸度就會成為紅色?？捡R斯亮藍能與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性。 ? 考馬斯亮藍 G250法（ Bradford法）是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的蛋白質(zhì)常用分析方法。此外在堿溶液中氨或銨鹽與銅鹽作用生成深藍色的絡(luò)離子 Cu(NH3)42+，妨礙此顏色反應(yīng)的觀察； 需先加 NaOH，再加 CuSO4，否則將產(chǎn)生藍色的 Cu(OH)2 試管壁有白色沉淀時停止加熱，冷卻 形成雙縮脲，用試紙試顯藍色 加 10%氫氧化鈉溶液 約 1ml 再加 1%硫酸銅溶液 2滴 觀察出現(xiàn)的顏色（粉紅） 再振蕩 尿素結(jié)晶約 1g 加熱 酒精燈 搖勻 加 10%氫氧化鈉溶液 約 1ml 再加 1%硫酸銅溶液 2滴 觀察出現(xiàn)的顏色 （ 紫玫瑰色 ） 再振蕩 蛋白質(zhì)溶液 10滴 搖勻 觀察出現(xiàn)的顏色 （紫玫瑰色帶藍） 5滴 1%硫酸銅 使氨放盡 產(chǎn)生Cu(OH)2 ? 茚三酮反應(yīng)：取 1支試管加入蛋白質(zhì)溶液 10滴，再加 10滴%茚三酮水溶液，混勻，在酒精燈上加熱，觀察顏色由透明到乳白色、紅色，再到紫紅色，再變藍。 加 1%硫酸銅溶液 2滴 再加 10%氫氧化鈉溶液約 1ml 觀察出現(xiàn)的顏色 （較深的藍紫色） 再振蕩 蛋白質(zhì)溶液 10滴 搖勻 觀察出現(xiàn)的顏色 （紫玫瑰色帶藍） 5滴 1%硫酸銅 考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取 7支試管，按下表操作。 根據(jù)所測樣品提取液吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（ μg ），按下式計算： )( (m l ) g / m l )()g / g( g樣品鮮重 提取液總體積查得的蛋白質(zhì)含量鮮重樣品蛋白質(zhì)含量 ?? ??雙縮脲法測蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取 14支試管，分兩組按下表平行操作。 討論 現(xiàn)象 解釋現(xiàn)象 雙縮脲反應(yīng)尿素 雙縮脲反應(yīng)卵清蛋白 茚三酮反應(yīng) 黃色反應(yīng) 反應(yīng)現(xiàn)象 考馬斯亮藍法與雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣液濃度 計算雞蛋清的蛋白質(zhì)含量 兩種測定方法的優(yōu)缺點 其它測定蛋白質(zhì)含量的方法的原理與優(yōu)缺點 注意事項 （ 1） 如果測定要求很嚴(yán)格 ， 可以在試劑加入后的 520 min內(nèi)測定光吸收 ， 因為再這段時間內(nèi)顏色最穩(wěn)定 。 測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈 。須于顯色后 30min內(nèi)比色測定 。 各管由顯色到比色的時間應(yīng)盡可能一致 。 8 作業(yè) ? 預(yù)習(xí)實驗 28
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