【正文】 、脂肪發(fā)育過程中的時空 表達(dá)譜，尤其是 miRNA在骨骼肌和脂肪發(fā)育過程中的表達(dá)譜，并闡明其對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用； 闡明 5 種以上 miRNA 對骨骼肌和脂肪干細(xì)胞增殖、分化過程中的調(diào)控機(jī)制。 承擔(dān)單位： 南京大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 朱敏生 經(jīng)費(fèi)比例： 24％ 15 課題 骨骼肌和脂肪發(fā)育過程中功能基因與細(xì)胞代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 主要研究內(nèi)容 骨骼肌和脂肪發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的鑒定 運(yùn)用表達(dá)譜芯片等 技術(shù)研究肌肉和脂肪細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)模式的變化，同時結(jié)合生物信息學(xué)比較、基因克隆、染色體定位及過量表達(dá)等技術(shù)，對細(xì)胞分化及干細(xì)胞自我更新等過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子（包括部分已知的 Pax 家族基因、 MyoD、 myoG、 PPARs、 C/EBP、 E2F 家族、 SREBP1c、STAT CREB 和 BMAL1 等）以及一些在脂肪型和瘦肉型豬群體中表現(xiàn)有顯著差異的新基因（如 LATS SMAD CNTF、 CNTFR 和 miR 24 等）進(jìn)行著重研究。研 究肌肉和脂肪前體干細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子參與細(xì)胞分化和成熟的調(diào)控機(jī)制，從而解析骨骼肌和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過轉(zhuǎn)錄因子 /DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)合報告基因技術(shù)、采用高效毛細(xì)管電泳法、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增（ AIMS）、Gelshift 技術(shù)和染色質(zhì)免疫共沉淀（ ChIP 或 ChIPonchip）等技術(shù)驗(yàn)證肌肉和脂肪細(xì)胞 分化過程中轉(zhuǎn)錄因子及其與轉(zhuǎn)錄輔助因子的相互作用的網(wǎng)絡(luò)。從而構(gòu)建骨骼肌和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及其在表觀遺傳水平上的調(diào)控機(jī)制。 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以 Perilipin 基因敲除動物為模型，研究 Perilipin 基因敲除導(dǎo)致脂肪重量減少但肌肉組織重量增加的調(diào)節(jié)機(jī)制，以及 Perilipin 在 PPARγ 介導(dǎo)的脂肪生成與脂肪細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用，探討肌肉和生長、脂肪沉積的形成機(jī)理。 脂肪代謝關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶類對肌肉、脂肪生長發(fā)育以及對肉品質(zhì)影響 以 HSL、 ATGL、 CGI58 等基因和相應(yīng)蛋白質(zhì)作為切入點(diǎn)，從 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，及其對脂肪分解代謝的調(diào)節(jié)作用特征，分析它們與脂肪和肌肉組織發(fā)育的關(guān)系以及對肉品質(zhì)的影響；分析它們在不同生長發(fā)育時期的變化特點(diǎn)，并從細(xì)胞水平上應(yīng)用基因表達(dá)和沉默技術(shù)研究這些關(guān)鍵酶的功能及相互調(diào)節(jié)關(guān)系。 主要研究目標(biāo) 鑒定骨骼肌和脂肪干細(xì)胞自我更新和分化過程中調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子。研究骨骼肌和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 揭示激素、細(xì)胞因子、謝性核受體配體對脂肪生成和分解的調(diào)控作用和機(jī)制，并由此揭示脂肪生成、分化、以及能量代謝的機(jī)制與分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 發(fā)表 SCI 文章 10 篇，其中 IF5 的文章 5 篇；申請相關(guān)專利 12 項(xiàng)；培養(yǎng)博士研究生 57 人，碩士研究生 1012 人，博士后研究人員 13 人。 品種（系）間骨骼肌和脂肪發(fā)育的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 利用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析其發(fā)育差異，確定發(fā)育過程中差異的信號通路和關(guān)鍵因子，探討調(diào)控品種（系）間表型形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。同時采用高效毛細(xì)管電泳法、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增（ amplification of intermethylated sites， AIMS） 以及染色質(zhì)免疫共沉淀法（ ChIP）分析關(guān)鍵功能基因啟 動子序列的 DNA 甲基化以及組蛋白乙酰化等修飾狀態(tài)。同時，根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的肌肉和脂肪組織的 miRNA，比較其在不同物種和品系間的表達(dá)特點(diǎn)和差異，分析差異表達(dá) miRNA 的調(diào)控作用。在構(gòu)建的各類試驗(yàn)群體中分析這些因子與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)，獲取可以用于遺傳改良的分子標(biāo)記。 探討不同品種（系）肌肉或脂肪組織的生長發(fā)育差異的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。 19 發(fā)現(xiàn)和鑒定一批與骨骼肌和脂肪發(fā)育相關(guān)的因子 ，估計部分因子對經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳效應(yīng) 發(fā)表 SCI 文章 10 篇，其中 IF5 的文章 5 篇；申請相關(guān)專利 12 項(xiàng)；培養(yǎng)博士研究生 45 人，碩士研究生 1012 人。 分析現(xiàn)有 miRNA 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，尋找候選 miRNA （或 cluster） , 并在不同品系豬、 雞中驗(yàn)證它們與肌肉、脂肪發(fā)育生長的相關(guān)性。 進(jìn)行雞基因組提取及超聲波破碎及甲基化 DNA 免疫共沉淀富集，為表觀測序積累樣本。比較品種（系）間豬和雞骨骼肌和前脂肪細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等差異。 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因雞載體系統(tǒng)， 并在雞源細(xì)胞上驗(yàn)證其效率。 獲得 50 個候選 miRNA 和 25 個miRNA cluster，確定 14 個 miRNA的靶基因。 獲得高質(zhì)量的雞的 DNA 甲基化分析樣本。 篩選出品種（系）間骨骼肌和脂肪發(fā)育的差異表達(dá)基 因。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇，爭取 IF論文 4－ 6 篇。 繼續(xù)確定候選 miRNA 的靶基因，研究 miRNA在脂肪和肌肉胚胎發(fā)育中的生物學(xué)功能及其介導(dǎo)肌肉和脂肪系統(tǒng)發(fā)育的信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。 利用基因組改 造技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物。研究 SMAD CNTF 及CNTFR 和 miR24 在瘦肉型及脂肪型豬種中的表達(dá)譜差異，揭示與瘦肉表型豬發(fā)育形成相關(guān)基因。進(jìn)一步對所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究相關(guān)因素如環(huán)境溫度、病原體、營養(yǎng)素等對脂肪代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。篩選出品種（系）間骨骼肌和脂肪發(fā)育的差異表達(dá)基因。 獲得不同品種（系）豬、雞差異表達(dá) miRNA 的時序表達(dá)譜特征。 完成 LATS2 基因在細(xì)胞系中的功能分析。 完成雞基因組甲基化檢測及數(shù)據(jù)挖掘，初步闡述雞的與脂肪發(fā)育相關(guān)基因的表觀遺傳特點(diǎn)。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇以上，其中影響因子 5 的 4－ 6 篇。 進(jìn)行豬群體中 LATS2 基因與肌肉脂肪發(fā)育的相關(guān)性分析； 對SMAD CNTF 及 CNTFR 和 miR24在瘦肉型及脂肪型豬種中的表達(dá)譜差異的基因進(jìn)行重點(diǎn)研究，并對其上下游基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析監(jiān)測，揭示與瘦肉型豬發(fā)育形成的相關(guān)基因及通路。 Perilipin 對 PPARγ 介導(dǎo)的脂肪生成與脂肪細(xì)胞分化的影響。 開展 miRNA 雞場地生產(chǎn)培育實(shí)驗(yàn)。 闡明 LATS2 基因與肌肉脂肪發(fā)育在群體中的相關(guān)性；完成 SMADCNTF 及 CNTFR 和 miR24 中表達(dá)譜差異分析。 挖掘表觀數(shù)據(jù)，揭示其中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。闡明 Perilipin 對 PPARγ 介 導(dǎo)的脂肪生成與脂肪細(xì)胞分化的影響。 獲得首批 miRNA 雞 。 23 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 繼續(xù)上年度關(guān)鍵基因的功能和信號通路研究，同時分析關(guān)鍵功能基因在品種（系）的表達(dá)、啟動子區(qū)序列多態(tài)性以及 DNA甲基化及組蛋白修飾等差異。 研究 miRNA 對骨骼肌和脂肪干細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)及 miRNA 對介導(dǎo)肌肉和脂肪系統(tǒng)發(fā)育的信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。 研究 ATGL 對脂肪代謝的調(diào)節(jié)及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)系。 完成 510 個基因的功能和調(diào)控研究，解析候選分子標(biāo)志表達(dá) 調(diào)控的遺傳和表觀遺傳學(xué)機(jī)制。 揭示 SMAD CNTF 及 CNTFR和 miR24 與肌肉瘦肉性狀的相關(guān)性的細(xì)胞機(jī)制； 闡明 ATGL 對脂肪代謝的調(diào)節(jié)及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)系。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇以上，其中影響因子大于 5 的 SCI 論文 46 篇。 2．進(jìn)一步利用 表型分析轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物 研究特定 miRNA對肌肉和脂肪的發(fā)育分化調(diào)節(jié)機(jī)制。 掃描并驗(yàn)證在 Perilipin 及 PPARγ試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因?qū)χ敬x的影響，并分析其在豬群中的可應(yīng)用性。 闡明細(xì)胞外信號分子對關(guān)鍵功能基因基因表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制； 完成 36 個 骨骼肌和脂肪生長發(fā)育關(guān)鍵基因的表觀遺傳學(xué)分析 。 提出針對 14 個特定 miRNA 或 cluster 對肌肉、脂肪的調(diào)控機(jī)制。 脂肪的代謝組學(xué)的探索及其對肉質(zhì)性狀的研究 6. 鑒定出對豬和雞性狀有顯著效應(yīng)的相關(guān)基因 510 個， 選擇出用于育種的選擇標(biāo)記 5 個以上 。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇以上，其中影響因子 5 的 4－ 6 篇。