膠體金快速免疫診斷技術(shù)-在線瀏覽
2024-11-19 22:14本頁(yè)面
【正文】 m、40nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、41nm和50nm 顏色與顆粒的關(guān)系.最佳標(biāo)記顆粒大小40nm.,1％檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶膠顏色 藍(lán)灰 紫灰 紫紅 紅 橙紅 橙 吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518 徑粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15,膠體金的鑒定,1. 肉眼觀察：在日光下仔細(xì)觀察膠體金顏色，可以大致估計(jì)金顆粒大小。 2. 分光光度計(jì)掃描吸收峰時(shí)光波長(zhǎng)來(lái)估計(jì)金顆粒的大小。,免疫膠體金的制備 膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。鹽類成份能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在。 3.膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或略偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。,蛋白質(zhì)最適用量測(cè)定: 將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)（鼠抗人IgG）儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，5分鐘后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2小時(shí)。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10％，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。一般選用PEG（分子量為20000）和牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。,①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH。 ③加入5ml1%PEG20000溶液。 ⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 A540nm=1.5左右為宜，防腐置4℃保存。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2。,膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定 平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。(實(shí)驗(yàn)階段） 用噴點(diǎn)儀將膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG噴在玻璃纖維素膜上,真空干燥2 h 。 同時(shí)還有一個(gè)問(wèn)題是, 反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng), 發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大, 所以過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度.。 包被抗鼠IgG濃度篩選（C線） 抗鼠IgG抗體用PBS 梯度稀釋, 釋后用1μl移液器點(diǎn)在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用。,干 燥,干燥方法的比較 37度干燥４h：顆粒感較強(qiáng)，易中間白，周邊深。,試紙條組裝,在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼上包被好的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜下緣粘貼膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機(jī)將貼好的試紙板切成4
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