【正文】 一般 5－ 8個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比 RAPDs大得多。ISSRl 共同優(yōu)點(diǎn)： 在不需要知道所擴(kuò)增 DNA序列情況下，產(chǎn)生 DNA片段的指紋； 需 DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。SCARs（ Sequenced Characterized Amplified Regions）n 為提高 RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo) RAPD片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常 24個(gè)堿基），再進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)。植物中平均 SSR。l根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同 ,可分為單堿基、 2堿基、 3堿基、 4堿基等多種重復(fù)型。l通過(guò)對(duì) 54個(gè)植物種核 DNA和 28個(gè)植物種細(xì)胞器DNA SSR(14bp)的搜索 ,發(fā)現(xiàn)：l (AT)ｎ 最豐富 ,然后依次是 : (A)n、 (T)n、 (AG)n、(CT)n、 (AAT)n、 (ATT)n、 (AAC)n、 (GTT)n、 (AGC)n、 (GCT)n、 (AAG)n、 (CTT) n、 (AATT)n、 (TTAA)n、(AAAT)n、 (ATTT)n及 (AC)n、 (GT)n。SSR的分布特點(diǎn)SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為 SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理功能。SSR的主要功能 :　216。 染色體末端的 SSR，有保護(hù) DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能；216。 基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來(lái)源；216。v 不同材料重復(fù)次數(shù)的不同 ， 導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。ESTSSR、相關(guān)種間 SSR...l） 4181。l） dNTP（ 25mM） 加水至 20181。95℃ 95℃ 56℃ 72℃ GOTO31循環(huán)注： SSR引物退火溫度在 5265不等。不足：SSR的檢測(cè)u瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）u聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)u一般采用銀染、熒光檢測(cè)。AFLP（ Amplified Fragment Length Polymorphism)n 原理：n 基于 RFLP技術(shù)和 PCR技術(shù)的結(jié)合 GATGAGTCCTGAGTAA339。 GACTGCGTACCAATTC339。GACTGCGTACCAATTC339。GATGAGTCCTGAGTAANNN3‘EcoRIprimers +3: 539。GACTGCGTACATCGAGNNN3‘ AFLP技術(shù)的特點(diǎn)（ 1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類(lèi)很多，產(chǎn)生標(biāo)記數(shù)無(wú)限，可覆蓋整個(gè)基因組。（ 3） AFLP分析由于擴(kuò)增片段較短（ 30700bp)， 分辨率高。?g（ 5）由于特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽(yáng)性低，可靠性高。（ 7）銀染技術(shù)具有快速、方便的特點(diǎn)，在 12天內(nèi)可以得到指紋。酶切 連接；2.電泳分離（利用聚丙烯酰胺凝膠）。AFLP操作步驟：模板 DNA的酶切與連接DNA（ 200ng/181。接頭（ 50l） PstⅠ pmol/181。Buffer 100BSA l） l， 37℃ 酶切 連接 46小時(shí)，或過(guò)夜 。l如下混合液：MseⅠ l） PstⅠ l） Buffer Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。l 混合后，在如下 PCR條件下擴(kuò)增：Step1 95℃ 2分鐘Step2 95℃ 30秒Step3 56℃ 30秒Step4 72℃ 60秒Step5 GOTOStep231 72℃ 5分鐘AFLP的選擇性擴(kuò)增取 4181。l如下反應(yīng)液：PstⅠ 引物（ 50ng/181。MseⅠ 引物（ 50ng/181。Buffer dNTP（ 25mM） l） 混合后按如下 PCR程序擴(kuò)增：Step2 95℃ 30秒Step4 72℃ 60秒12循環(huán)Step7 56℃ 30秒Step9 GOTOStep6cycles72℃ 銀染216。 同位素檢測(cè)注意事項(xiàng) ：1． AFLP酶切反應(yīng)對(duì)模板 DNA質(zhì)量要求較高，要求 260/2802． AFLP反應(yīng)對(duì)模板 DNA濃度不是很敏感，在50pg50ng時(shí)，均可以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性， DNA濃度不能太低。4． AFLP反應(yīng)對(duì) PCR要求較高，要首先摸索優(yōu)化 Mg2+、 dNTP條件，達(dá)到最佳擴(kuò)增。6．引物中用作選擇性核苷酸的Ｇ和Ｃ含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影響。7為什么用雙酶解 ?適合 PCR擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率減少 PCR擴(kuò)增的片段 ,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標(biāo)記單鏈成為可能增加 PCR擴(kuò)增的靈活性增加使用引物的靈活性為什么要預(yù)擴(kuò)增 ?減少選擇性堿基的錯(cuò)配減輕背景提供足量模板 DNA降低模板濃度的影響目的：分子標(biāo)記輔助選擇 (MAS)篩選 BAC文庫(kù)，進(jìn)行圖位克?。?mapbased gene cloning）AFLP SCARPIC/Simpson遺傳多樣性系數(shù) = 1 ? Pi 2等位基因數(shù)目 A A = 4PIC = 1 – SUM ()2 + ()2 + ()2 + ()2 = SSR資料：遺傳相似系數(shù) Gower (1985): a + da + b + c + d簡(jiǎn)單匹配系數(shù)（ SM）(Simplecoefficient) a a + b + cJaccard1908). 2a2a + b + cDiceNeiLi:a bc d++kj遺傳距離的計(jì)算：Rogers（ 1972）RogersW （ Rogers distance as modified by Wright （ 1978）兩個(gè) 隨機(jī)群體 j 、 k間的遺傳距離（ Nei 1972）: Xij 為 X群體第 i個(gè)位點(diǎn)第 j個(gè)等位基因頻率 Yij為 Y群體第 i個(gè)位點(diǎn)第 j個(gè)位點(diǎn)基因頻率 n 在種質(zhì)資源研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（ RD）和改良的羅杰斯距離（ MRD）（Rogers， 1972； Goodman Stuber， 1983）。 聚類(lèi)分析n 聚類(lèi)指標(biāo)：遺傳相似系數(shù)遺傳距離n 聚類(lèi)方法： SAHN是長(zhǎng)約 150400bp的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完整基因的某些片段。n mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA， 克隆到質(zhì)?；蚴删w載體，構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，而后大規(guī)模隨機(jī)挑選克隆，對(duì) 5’或 3’端進(jìn)行一步法測(cè)序，獲得對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異、衰老死亡等過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)。(Expressed Sequence Tags)DNA Databanksn cDNA resourcesn Genbank (NCBI), Nucleotide Sequence Database (EMBL), DDBJ , MGC,…n Genomic DNA resourcesn HTG, dbGSS, GOLD, ERGO,…n EST resourcesn dbEST, UniGene, GIs, STACKS, DOTS,…n Othersn dbSTS, UniSTS, dbSNP, TransFac, ISIS, Repbase, ... ...常用基因組網(wǎng)址：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài) （ SNP single nucleotide polymophism）n SNP是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，即基因中的點(diǎn)突變。n SNPs可大大豐富既有的連鎖圖n 成熟自動(dòng)化技術(shù)，有望分析成千上萬(wàn)的 SNPsn 優(yōu)點(diǎn)：n 表達(dá)序列，與特定功能有聯(lián)系n 多態(tài)性豐富，可大大豐富標(biāo)記數(shù)目n 開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì) 利用 DNA芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻 /硅片上，然后用熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行大量分子雜交，以比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，分析基因表達(dá)模式。n 蛋白質(zhì)組研究 了解生物體蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空分布規(guī)律 , 不同個(gè)體 /組織間的表達(dá)差異n 蛋白質(zhì)分子標(biāo)記 定位