基因工程下游技術(shù)ppt課件-在線瀏覽
2024-10-22 18:26本頁(yè)面
【正文】 色譜分離法采用不同的樹脂及溶劑系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)物在該系統(tǒng)中不同的分配而被吸附或凝聚而得以分離。 （ 3）最后純化產(chǎn)品經(jīng)分裝凍干，包裝后即為成品。 如目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、帶電性、碳?xì)滏溁蜃杂蓭€基存在情況等。 ? 當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠層析（色譜技術(shù)）和電泳技術(shù)。 20221030 12 基因工程下游技術(shù) 20221030 13 基因工程下游技術(shù) ?大腸桿菌：凍融 、 超聲 、 溶菌酶 ?動(dòng)物 ， 植物細(xì)胞：勻漿 、 研磨 ：選擇合適 pH的緩沖液如 Tris、 磷酸鹽 、 醋酸鹽 、 檸檬酸鹽緩沖體系等 ， 保證待分離蛋白在此 pH條件下穩(wěn)定 。 ：低溫如 410℃ ， 蛋白酶活性較低 。 20221030 14 基因工程下游技術(shù) ：離心 、 超離心 ：酶法 DNase、 RNase；超聲 ：丙酮 、 脂肪酶 ： NaCl、 (NH4)2SO4沉淀 ：甲醇 、 乙醇 、 丙酮 ：除去雜蛋白 ：除去雜蛋白 20221030 15 基因工程下游技術(shù) 處理介質(zhì) ↓ 裝柱 ↓ 平衡 ↓ 上樣 ↓ 洗滌 ↓ 洗脫 ↓ 介質(zhì)再生 層析法、色譜法 一般步驟： 20221030 16 基因工程下游技術(shù) ：將蛋白質(zhì)按照分子量的大小分開 原理 以分子大小和形狀為分離基礎(chǔ)的 。另外一種說法是分離是以分子體積的大小為基礎(chǔ)的 ,分子體積即分子溶劑化后的體積 ,受分子形狀和相對(duì)分子質(zhì)量?jī)煞矫嬉蛩氐挠绊憽? 20221030 17 基因工程下游技術(shù) 介質(zhì)： (1) Sephadex: (交聯(lián)葡聚糖 ) G25, G50, G75, G100 Biogel: (聚丙烯酰胺 ) P6， P30， P60， P100 Sepharose: (瓊脂糖 ) 2B, 4B, 6B (2) Sephacryl（ 葡聚糖 聚丙烯酰胺 ) : S100, S200, S300 (3) Sepharose、 Superose: HPLC (4) superdex (瓊脂糖 葡聚糖 ) : HPLC 20221030 18 基因工程下游技術(shù) 20221030 19 基因工程下游技術(shù) 原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開 。弱酸型 C、 CM 陰離子：強(qiáng)堿型 TEAE、 QAE、 SE、 SP。具體說就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異 ,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同 ,用不同的 pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫 ,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。 ? 洗脫方式： 陽(yáng)離子交換主要是改變 pH,它主要應(yīng)用于等電點(diǎn)大于 5的蛋白質(zhì) 。 ? 離子交換層析 處理量大 ,附載系數(shù)高 ,一步縮小樣品體積很多。 ? 離子交換層析 的洗脫一般分 3種 :同步洗脫、分步洗脫 、梯度洗脫。 介質(zhì)準(zhǔn)備： 載體選擇 ： Sepharose 4B、 Sepharose CL 4B、 Sepharose Fast Flow、 Sepharose High Performance 空間臂 ： 偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或ε －氨基己酸。 效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。具體說就是利用蛋白質(zhì)和介質(zhì)特殊的生物親和性或?qū)Ｒ恍院推渌鞍踪|(zhì)分離的柱層析方法。 ? 親和層析 的三個(gè)基本條件是 : 偶聯(lián)凝膠 :起支架作用； 配體 :在支持物和分離物間起聯(lián)接作用 ,和分離物特異的親和吸附具有專一性 ,并且是可逆的。從理論上來講 ,其得到的是相當(dāng)純的物質(zhì) ,這種分離能力是其他任何柱層析都難以相比的 ,但由于親和層析柱制作工藝復(fù)雜 ,同時(shí)在色譜洗脫過程中配體不可避免的脫落 ,不但柱子的使用壽命有限 ,而且產(chǎn)品必須經(jīng)特別處理才可注射或服用 ,因此成本比較昂貴 ,一般不放在純化工藝的前面。 ? 洗脫方式： pH梯度洗脫、競(jìng)爭(zhēng)配體洗脫、有機(jī)溶劑洗脫、螯合劑洗脫。 ? 某些蛋白質(zhì)、氨基酸和一些金屬離子的特異親和力舉例如
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