westernblotting技術(shù)實(shí)驗(yàn)室專用-在線瀏覽
2024-10-01 13:23本頁(yè)面
【正文】 /μlb) 按50：1配Solution A：Solution B混合液，每個(gè)樣本需2 ml。 f) 4℃、12000 rpm離心30 min，上清即為總蛋白。d) 加入一定量的PMSF，使其終濃度為1 mM。注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白濃度達(dá)到10 g/l左右為佳。Western blotting1. 總蛋白的提取a) ml離心管中。b) 每管加一定量的蛋白裂解液。c) 用勻漿棒進(jìn)行勻漿（冰中進(jìn)行）。e) 冰中放置30~60 min?？煞?0℃保存待用。c) 在每個(gè)試管中加入2 ml Solution A：Solution ml 樣本，于60℃水浴30 min。B. 測(cè)樣品濃度a) 用10 mM TrisHCl（pH=）稀釋樣品100倍。c) 測(cè)OD562nm。3. SDSPAGE電泳A. PAGE膠的制備（5%濃縮膠、10%分離膠）。倒膠前加入20 μl的10%過(guò)硫酸銨（APS）以及2 μl的TEMED，輕輕混勻，緩慢注入兩玻璃板之間（ cm處）。待膠凝固，吸干膠上面的水。倒膠前加入10 μl的10% APS以及2 μl的TEMED，輕輕混勻，緩慢注入兩玻璃板之間分離膠的上方，加滿，插入梳子。B. 蛋白樣本制備取20~100 μg的總蛋白，加入同樣體積的2蛋白上樣緩沖液，于沸水中煮5 min，然后6000 rmp
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