第8章-標(biāo)記-在線瀏覽
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【正文】 的標(biāo)志物標(biāo)記。 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss15 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss16 （分子燈塔探針） 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss17 三、核素標(biāo)記 ? （一）核酸探針傳統(tǒng)的標(biāo)記物是用放射性同位素，多用 32P dNTP、 3H dNTP 、 35S dNTP等。 35S的前體標(biāo)記物 NTP或 dNTP是借助以取代與磷酸共價(jià)相連的氧原子制成的。 （三）幾種常用放射性同位素比較 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss20 常用放射性核素的物理性質(zhì) 核素 半衰期 100%純度時(shí)核素放射性活性 (Specific activity) (Ci/mmol) 放射粒子的最大能量 Emax(KeV) ? ? 3H 29 － 14C 5100年 62 156 － 32P 9120 1710 － 35S 1490 169 － 125I 60天 2400 131I 16100 608 365 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss21 NTP或 dNTP的 ?磷酸位上。 Nucleotide labeling 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss22 ? 32P or 33P 可取代 dNTP或 NTP不同磷酸位上的 P原子 ， 35S可取代核酸中磷酸分子上的一個(gè) O原子， 3H取代 H原子。 ? 隨機(jī)引物與線性 DNA模板雜交，在 DNA聚合酶的催化下，從引物的 3′ 末端開始按 5′→3′ 方向合成與模板 DNA互補(bǔ)的 DNA鏈，如有 [α 32P]dNTP或其他標(biāo)記物的摻入，就可產(chǎn)生標(biāo)記的 DNA探針。 放射自顯影檢測(cè)。用酶聯(lián)抗地高辛抗體檢測(cè)。 放射自顯影檢測(cè) ?particles blacken Xray film DNA固定在雜交膜上 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss31 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss32 （ 2）切口平移法（ Nick Translation） ? 原理及過程： ? 當(dāng)雙鏈 DNA分子的一條鏈有切口時(shí)，大腸桿菌 DNA聚合酶 I可把核苷酸殘基加到切口處的 3’ 羥基端。 5’端除去與 3’端加入核苷酸同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著 DNA模板鏈移動(dòng)。 DNA聚合酶 I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。 （ 2）將克隆于特定載體上靶序列轉(zhuǎn)錄成 RNA的探針。 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss36 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss37 DNA探針 在 PCR循環(huán)過程， Tag DNA聚合酶可將標(biāo)記的 dNTP摻入 DNA鏈中，用此法制備的探針靈敏度高，數(shù)量大。pNpNp………NpNpN OH3180。pNpNpNpNp………Np (a) NpApA—pA－－ H 3180。末端標(biāo)記（ 3180。末端標(biāo)記 (b) 雙鏈 DNA 用 DNA 聚合酶 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss43 5180。 DNA 3180。 dAp*pp ??? DNA 聚合酶 + ?32PdATP + dCTP, dGTP, dTTP 5180。 5180。 3180。 3180。 5180。 3180。 用 BamHI 限制性內(nèi)切酶消化 RE DNA 片斷 3180。末端標(biāo)記（ 5180。 ? 適用于 RNA和雙鏈或單鏈 DNA。 ? DNA 5′ 末端的磷酸根，用堿性磷酸酶去磷酸化，再用 T4多核苷酸激酶將 [ γ 32P ]ATP的γ 32P轉(zhuǎn)移到 DNA 5′ 端的羥基上。末端標(biāo)記 5180。 DNA or RNA 5180。 + App (ADP) T4多核苷酸激酶 + g32PATP 堿性磷酸酶 (eg CIP) 5180。 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss47 體外轉(zhuǎn)錄
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