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2024-09-14 18:09本頁(yè)面
【正文】 等特點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。但其粘度和對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增大。但相對(duì)分子量400~6000，濃度在 10%~50%范圍之間的 PEG都能使細(xì)胞融合。但是， PEG和 DMSO都對(duì)細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格限制它們和細(xì)胞的接觸時(shí)間，可通過(guò)低速離心 5min使細(xì)胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來(lái)稀釋藥物并洗滌細(xì)胞。其中氨基喋呤（ A） 能阻斷 DNA合成的主要途徑，瘤 瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成 DNA而死亡。由于 SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤（ H） 鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT） 缺乏株，脾細(xì)胞中卻有這種酶，因此脾 瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用 HGPRT酶，用次黃嘌呤（ H） 和胸腺嘧啶（ T） 合成 DNA， 使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng) 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細(xì)胞懸浮于 HAT的培養(yǎng)液（配方見(jiàn)書(shū)中表 42），加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每 2~3天換液一次。在融合后 7天內(nèi)用 HAT培養(yǎng)液，殺死瘤 瘤融合細(xì)胞后，第 7~14天改用 HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的 RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書(shū)中表 43），從融合后 8~9天就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。 ? 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。 ? 為了盡快地篩選出陽(yáng)性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡(jiǎn)便并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本的方法。一般來(lái)說(shuō)，免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測(cè)。 精制破傷風(fēng)毒素抗原（ ）吸附 （約 10?g/ml， 4℃ ， 3h） 洗滌 加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ） （ 4℃ ， 1h） 加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（ ） （ 4℃ ， 1h） 洗滌 洗滌 加酶作用底物，呈色孔為陽(yáng)性克隆孔 ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 ? （ 2）克隆化 —— 有限稀釋法和軟瓊脂法 ? 篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中，可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞 ，而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應(yīng)盡早克隆化。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用 HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含 HT的 RPMI1640培養(yǎng)液。 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 ? （ 2）克隆化 —— 有限稀釋法和軟瓊脂法 ? 軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入 %左右的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團(tuán)塊打碎后，移入 96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 1）雜交瘤細(xì)胞的鑒定 ? 正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為 40，全部是端著絲粒染色體。雜交瘤細(xì)胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 2）抗體性狀的鑒定 ? 由于不同類(lèi)和不同亞類(lèi)的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，諸如補(bǔ)體活化、免疫調(diào)理、 ADCC效應(yīng)等等，因此要對(duì)制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)行 Ig類(lèi)和亞類(lèi)的鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類(lèi)和亞類(lèi)的抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或 ELISA法來(lái)鑒定。另外根據(jù)需要不同，還應(yīng)對(duì)單克隆抗體的特異性、純度和識(shí)別抗原的相對(duì)分子量等進(jìn)行測(cè)定。目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體。 ? 為了使雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖良好，可于注入細(xì)胞的幾周前，預(yù)先將具有刺激性的 有機(jī)溶劑降植烷（ pristane） 注入腹腔內(nèi)，以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。 五、單克隆抗體的大量制備 ? 書(shū)中介紹了體外培養(yǎng)法和動(dòng)物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來(lái)發(fā)展的方法。 ? 利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細(xì)胞生長(zhǎng)空間，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提高。如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可達(dá) 108細(xì)胞 /ml。此稱(chēng)為微載體懸浮培養(yǎng)法，固體顆粒用 DEAESephadex A 50等材料制成。 ? 分離 ? 根據(jù)用途可選用不同的方法，主要分離方法有凝膠過(guò)濾、陰離子交換層析、親和層析等。常用 Sephadex G200作分離介質(zhì)，可收集到三個(gè)峰，最高峰為 IgM， 另兩個(gè)峰為 IgG， 抗體回收率達(dá)50%~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達(dá)95%以上。在 ， IgG1和 IgG2能結(jié)合在 DEAE填料上，其中 IgG2a可在較低離子強(qiáng)度條件下洗脫下來(lái)，其純度較高。在，把雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時(shí)，所有的
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