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2024-08-24 14:38本頁面
【正文】 為SuperScript 和SuperScriptⅡ。反轉(zhuǎn)錄PCR 二、合成cDNA引物的選擇 1． 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。 3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。反轉(zhuǎn)錄PCR 三、操作步驟 1. 總RNA的提取?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。 然后加入下列試劑的混合物： 10PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl DTT 2μl 輕輕混勻，離心。 （3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。 （5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。 3．PCR： ?。?） PCR管，依次加入下列試劑： 第一鏈cDNA 2μl 上游引物（10pM） 2μl 下游引物（10pM） 2μl dNTP(2mM) 4μl 10PCR buffer 5μl Taq 酶（2u/μl） 1μl ?。?） 加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。 ?。?） 設定PCR程序。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。 ?。?） 密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。 3． 內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定。 ?。?） 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。巢式PCR 定義 巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。因此，巢式PCR的擴增非常特異。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。PCR技術的基本原理PCR
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