【正文】 透性的上升，電解質(zhì)外滲，使電導(dǎo)率值變大，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷（江福英，2002），MDA含量的增量與抗凍性有顯著的負(fù)相關(guān)性。馬艷青等(2000)對(duì)辣椒抗寒性進(jìn)行研究的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后各品種的辣椒其MDA含量都得到了不同程度的增加，并且增加的程度與不同品種辣椒的抗寒性有關(guān)，抗寒性強(qiáng)的其MDA含量增加的少，抗旱性弱的增加的多。 可溶性糖與植物的抗寒性可溶性糖是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它在植物的抗寒生理中，可以提高細(xì)胞液的濃度、降低滲透勢、增加保水能力，從而使冰點(diǎn)下降(王淑杰，1996)，同時(shí)糖還是冰凍保護(hù)劑，對(duì)線粒體、原生質(zhì)體及膜上敏感偶聯(lián)因子均有保護(hù)作用(Trunova，1982)，它也可能對(duì)冰凍敏感的蛋白質(zhì)具保護(hù)作用(劉祖祺，1994)，還可以促進(jìn)ABA的積累，間接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而提高植物的抗寒能力(陳杰忠，1998)；另外，糖還可提供能源與代謝底物，誘導(dǎo)其他與抗性有關(guān)的生理生化過程，如脂肪的合成，有利于提高抗寒力。在低溫脅迫下，植物體中保護(hù)酶活性的強(qiáng)弱直接關(guān)系到抗低溫傷害的能力（劉鴻先等，1985）。保護(hù)酶系統(tǒng)包括超氧歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等還原性物質(zhì)。試驗(yàn)中，隨著低溫傷寒程度的發(fā)展，細(xì)胞的SOD活性出現(xiàn)遞減的降低，耐寒力較強(qiáng)的細(xì)葉結(jié)縷草SOD活力的下降值小于耐寒力較弱的假儉草和地毯草，表明植物細(xì)胞中的SOD活性降低與細(xì)胞膜的損傷有一定的關(guān)系。CAT是清除H2O2的主要酶類，還可以清除線粒體電子傳遞。 氣候條件影響植物的分布、生長發(fā)育，而水分條件是決定植物發(fā)展類型的主要限制條件。目前，世界上有三分之一的可耕地處于供水不足的狀態(tài)?！≈参锖乃笥谖畷r(shí)，植物體內(nèi)即出現(xiàn)水分虧缺，水分過度虧缺的現(xiàn)象稱為干旱（李合生，2006）。一是土壤干旱。二是大氣干旱。氣溫高、強(qiáng)烈的太陽輻射能顯著促進(jìn)蒸騰；由于土壤干燥、地溫低、根的機(jī)能低下，使吸水受到抑制。目前，植物抗旱性的研究方法有多種，大多是在人工控制的干旱或人工模擬干旱條件下進(jìn)行。每天定時(shí)稱取盆重，補(bǔ)充當(dāng)天失去的水分，使各處理保持設(shè)定的相對(duì)含水量，然后測定其相關(guān)指標(biāo)。目前常采用聚乙二醇（PEG）滲透脅迫法。采用PEG滲透脅迫，人工控制的溫室、氣候室和培養(yǎng)箱等（石大偉，1984；胡榮海1986；黎裕，1994）。干旱引起植物水分脅迫，從而對(duì)植物的生長、呼吸作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用、營養(yǎng)代謝激素調(diào)節(jié)和滲透等產(chǎn)生不良影響，進(jìn)一步影響植物的生長發(fā)育。Mazzoleni等(1988)對(duì)2個(gè)楊樹雜種無性系根莖比的研究表明，干旱脅迫下根系的生物量積累相對(duì)較高、根莖比較大，脅迫解除后根莖比有所下降。顧振瑜等在研究1年生元寶楓幼苗在土壤干旱脅迫下生長反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨土壤含水量降低，幼苗的株高、根長、莖葉重、根重、莖粗均隨之降低(顧振瑜，1999)?？芍苯臃从持参飳?duì)干旱脅迫的抵抗能力，通過測定葉綠素含量的變化可以確定大葉冬青抗旱性的強(qiáng)弱?？灼G菊（2006）在研究干旱脅迫對(duì)黃櫨幼苗的生理指標(biāo)影響結(jié)果表明，多數(shù)情況下黃櫨處理的葉綠素a/ b要高于對(duì)照，隨著干旱脅迫程度的加劇和時(shí)間的延長，黃櫨的葉綠素含量都有上升趨勢。這種結(jié)果與黃顏梅（1998）對(duì)藏柏的研究結(jié)果相似。丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過氧化降解的產(chǎn)物，因其測定方法簡便易行，且能夠表示植物的氧化脅迫狀況，因此，測定植物脅迫下MDA含量的變化可以了解植物脅迫下的膜脂過氧化程度（王榮華，2003）。而閻秀峰（1999）等研究發(fā)現(xiàn)膜透性與MDA含量之間的變化不一致，因此，認(rèn)為膜透性的增大并不完全是由膜脂過氧化造成的，可能還存在著其它的反應(yīng)參與了此過程。全炳武等（2008）研究濱麥在PEG6000脅迫下結(jié)果表明保護(hù)酶活性在輕度脅迫下升高，而中度或重度脅迫下活性降低或不變。很多實(shí)驗(yàn)也證明，在干旱脅迫前期SOD、 POD活性有增加趨勢，這種增加是植物適應(yīng)干旱脅迫條件下，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧累積與清除系統(tǒng)平衡的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)，是減輕細(xì)胞傷害的一種反饋性代謝變化，但是脅迫時(shí)間的延長或者脅迫程度過大，SOD、POD活性大幅度下降。2引言大葉冬青（Ilex latifolia)又名苦丁茶，是冬青科冬青屬常綠闊葉喬木。高可達(dá)20m，樹形優(yōu)美，枝葉濃蔭，具有很高的觀賞價(jià)值。因此引種栽培大葉冬青具有很高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但是，長期以來，在我省園林綠化中常見的常綠闊葉樹種并不多，尤其是常綠闊葉喬木樹種更是寥寥無幾，只有香樟、大葉黃楊、廣玉蘭和大葉女貞等幾種。由于大葉冬青主要分布地為溫暖濕潤的氣候，因此干旱、低溫是其引種的主要限制因子。因各樹種生物學(xué)特性不同，以上兩種低溫危害都可能在某些樹種中表現(xiàn)。一般來說，溫度愈低，低溫持續(xù)時(shí)間愈長，溫度回升的越急劇，則寒害也越嚴(yán)重。干旱是影響植物生長的重要環(huán)境因素之一，世界上約有2/3的地區(qū)屬于干旱、半干旱地區(qū)。因此，探討干旱脅迫下大葉冬青的生理指標(biāo)的變化對(duì)于園林應(yīng)用及抗旱栽培具有重要意義（Gergely，1980）。3試驗(yàn)材料與方法 供試材料 選用2年生大葉冬青作為試材，由安徽省六安市太平鎮(zhèn)苗圃場提供?；|(zhì)用草炭：珍珠巖：蛭石（體積比2:1:1），盆底部放置托盤。 抗寒性研究2009年7月，取生長一致、株高45cm左右的苗木進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)。處理24h后取第5片葉以上的莖段和葉片測定相關(guān)生理指標(biāo)。①溫度緩慢下降的試驗(yàn)方法。隨后放入不同溫度條件下進(jìn)行低溫脅迫。② 溫度驟然下降的試驗(yàn)方法。然后每3h降低5℃，直至降到6℃。葉綠素含量的測定——參照鄒琦（2000）的方法進(jìn)行測定膜透性的測定——電導(dǎo)法半致死溫度LT50——將膜傷害率代入Logistic 方程進(jìn)行擬合，計(jì)算可溶性糖——蒽酮比色法SOD活性的測定——抑制氮藍(lán)四唑法（NBT）光化還原法POD活性的測定——愈創(chuàng)木酚法CAT活性的測定——紫外吸收法 抗旱性研究試驗(yàn)于200907在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)開始將大葉冬青苗置于GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），光照度12 000 LX，溫度28℃。L1)、 S2 (200 gL1)。每個(gè)處理4盆（1株/盆），3次重復(fù)。取第l片完全展開葉下數(shù)的第3～8片葉，在液氮中迅速冷凍后置于70 ℃冰箱保存待測。記錄重量（W）。當(dāng)葉片組織完全變白時(shí)，以80%的丙酮作為對(duì)照測定在波長663nm、和645nm下的吸光度（OD）值，按下列公式計(jì)算出色素提取液的濃度：C（）＝+再根據(jù)下列公式計(jì)算色素含量：色素含量（）= C提取液體體積 W103葉綠素a的含量（Ca）＝（ A645）V/1000W葉綠素b的含量（Cb）＝（ ）V/1000W葉綠素總含量（C總）＝Ca+ Cb=（+）V/1000W其中：V ——提取液總體積（ml）W ——樣品鮮重（g） 電導(dǎo)率的測定儀器及用具：電導(dǎo)儀；水浴鍋；打孔器；大試管；紗布。共測定3次電導(dǎo)率（1）1min后震蕩搖勻用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)值E0，（2）在室溫下放置24h后，充分搖勻測定電導(dǎo)值E1，（3）測完E1后，在沸水浴中加熱15min后，冷卻至室溫測定電導(dǎo)值E2，根據(jù)公式計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率（L）。 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行非線性回歸分析，用Logistic曲線擬合求出拐點(diǎn)溫度，作為半致死溫度(LT50)。蒽酮比色法原理：糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。試劑：蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1克，溶于50ml乙酸乙酯中,貯于棕色瓶中,在黑暗中可保存數(shù)星期,如有結(jié)晶析出,可微熱溶解；濃硫酸。取新鮮葉片，擦凈表面的污物，剪碎混勻，共四份。反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，將過濾好的溶液稀釋4倍。吸取樣品液的體積提取液量稀釋倍數(shù)樣品干重106可溶性糖含量＝100％從回歸方程求得糖含量（SOD）活性的測定儀器與用具：高速離心機(jī)；分光光度計(jì)；熒光燈（反應(yīng)試管處光照強(qiáng)度為4000lx）試管數(shù)支；比色皿。方法：取比色皿，加入下列試劑表31 SOD反應(yīng)液組分表Table 31 The ponent of SOD reaction mixture試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時(shí)） PH=130mM Met溶液13mmol/L100uM EDTANa2液75μmol/L750uM NBT液10μmol/L20uM 核黃素酶液對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水總體積將各管中的溶液混合均勻后，1支對(duì)照管放置在暗處，1支與酶液一起放入4000 Lx日照燈下反應(yīng)20min（各個(gè)試管受光要一致，溫度為25℃）。以不照光的對(duì)照管做空白，分別測定其它各管在560nm處的吸光值。SOD總活性=（ACK－AE）VACKWVt50%式中：ACK——照光對(duì)照管的吸光度AE——樣品管的吸光度V——酶液總體積（ml）W——樣品鮮重（g）Vt——反應(yīng)中加入的酶液體積（ml）（POD）活性的測定 采用Cutler JM（1980）的愈創(chuàng)木酚法方法進(jìn)行測定，略加改動(dòng)。試劑：PH ；愈創(chuàng)木酚（%）；%的H2O2 方法步驟：在試管中加PH （）2 ml，愈創(chuàng)木酚（%），%的H2O2 ，空白以緩沖液代替?！鰽 V△tμW酶活力 =式中：△A——吸光度的差值△t——反應(yīng)的時(shí)間差（min）W——樣品鮮重（g）V——反應(yīng)液體積（ml） μ——加入的酶液體積（ml）（CAT）活性的測定 采用湯章城（1998）的方法進(jìn)行測定，略加改動(dòng)。試劑：蒸餾水；=；30%的H2O2?？瞻滓跃彌_液代替，總體積為3ml，在240nm下比色，加入酶液時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10s讀取數(shù)據(jù)一次。儀器與用具：剪刀；離心機(jī)。將待測葉片擦拭干凈，剪碎。4ml 5％TCA沖洗轉(zhuǎn)移至離心管中；在3000r/min下離心10min，提取上清夜。2ml蒸餾水+2ml %TBA混合液作為對(duì)照，分別測定上清夜在450nm、532nm、600nm處的吸光度A450 、A53A600。4結(jié)果與分析葉綠素總含量?？勺鳛橐环N反映逆境脅迫對(duì)植物造成傷害程度的生理指標(biāo)，用以說明環(huán)境條件的變化對(duì)植物產(chǎn)生的影響。緩慢降溫下葉片葉綠素含量的變化見圖41。這可能是大葉冬青為了維持正常的光合作用主動(dòng)適應(yīng)低溫環(huán)境的結(jié)果,表現(xiàn)在葉綠素上就是其含量有所回升。12℃、18℃處理下隨著低溫脅迫時(shí)間的延長葉綠素含量下降，即脅迫程度增加，葉綠素含量下降的幅度也增加。驟然降溫下葉片葉綠素含量的變化見圖42圖42 驟然降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化Fig42 Effect of rapid cooling chill stress on chlorophyll content of broadleaf holly leaves由圖42可見，驟然降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化基本呈現(xiàn)下降的趨勢，但6℃、0℃處理下葉綠素含量變化不明顯，表明葉綠素含量對(duì)驟然降溫不敏感。6℃處理下葉綠素含量下降幅度最多，受影響的程度也最大，在48h時(shí)葉綠素含量開始下降，%。在低溫脅迫下植物的細(xì)胞膜會(huì)遭到破壞，質(zhì)膜透性增大，從而使植物細(xì)胞的電導(dǎo)率增大，抗寒性較強(qiáng)的植物細(xì)胞不僅透性增大的程度較小，并且透性的變化可以逆轉(zhuǎn)，易于恢復(fù)正常（劉鵬，2004）。圖43 緩慢降溫下大葉冬青葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化Fig43 Effect of slow cooling chill stress on relative electrical of broadleaf holly leaves由圖43可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，四種低溫脅迫的電導(dǎo)率呈一致的變化趨勢，為“S”形變化曲線。 隨后，電解質(zhì)滲出曲線上升，在72h后，12℃、18℃處理下達(dá)到了最大值，%、%，上升幅度變化較大。大葉冬青葉片在驟然降溫下的相對(duì)電導(dǎo)率變化如圖44 所示。6℃、0℃處理在整個(gè)過程變化幅度較小，%、%。6℃處理的電導(dǎo)率在整個(gè)過程的變化均高于對(duì)照。大部分研究者認(rèn)為,植物材料在傷害度為50%時(shí)的脅迫因子的水平具有特殊的生理學(xué)意義，已廣泛應(yīng)用于抗性研究中。緩慢降溫下大葉冬青葉片相對(duì)電導(dǎo)率隨處理溫度的變化見圖45。24h以上處理時(shí)間對(duì)應(yīng)的“S”形曲線可以計(jì)算出拐點(diǎn)溫度，℃℃之間(見表41)，這是大葉冬青抗寒能力的重要指標(biāo)。膜脂的過氧化作用可直接導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞以及細(xì)胞膜透性的增加。緩慢降溫下大葉冬青葉片MDA含量的變化見圖46所示。在24h時(shí)第一次測定葉片中的MDA含量就開始增加，除18 ℃增幅較大外，%。48h時(shí)各處理MDA含量持續(xù)上升，至72h處理時(shí)各處理MDA含量均達(dá)到峰值，%、%、%、%。驟然降溫下大葉冬青葉片MDA含量的變化見圖47所示。表現(xiàn)為三個(gè)階段，即冷激階段（24h）、適應(yīng)階段（48h）、和傷害階段（72h后）。 低溫脅迫對(duì)大葉冬青葉片可溶性糖含量的影響可溶性糖作為滲透保護(hù)物質(zhì)，可以提高細(xì)胞液的濃度，以增加細(xì)胞持水組織中的非結(jié)冰水，從而降低細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)，還可緩沖細(xì)胞質(zhì)過度脫水，保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膠體不致遇冷凝固。 圖48 緩慢降溫下大葉冬青葉片可溶性糖含量的變化Fig48 Effect of slow cooling chill