【正文】 線 19 未知樣品的測量 ?在同等條件下，用待測抗原與一定量的標(biāo)記抗原與限量特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，并用同樣的方法分離待測抗原的 B和 F， 測量其放射性，計算出 B/F， 在劑量反應(yīng)曲線上就可以查出對應(yīng)的抗原濃度。 這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競爭時 ， 標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達(dá)最大值 。 NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體 ， 在相同條件下反應(yīng)后測得的放射性 。 表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性 。 一般在反應(yīng)后分離出沉淀 ， 測定沉淀的放射性作為 B。 24 選用不同的反應(yīng)變量作縱坐標(biāo) ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀也不同 。 25 標(biāo)準(zhǔn)曲線 左：橫座標(biāo)為等份刻度；右：橫座標(biāo)為對數(shù)刻度 26 （一）標(biāo)準(zhǔn)抗原 ?是廠家給出已知劑量的非標(biāo)記抗原。 二、 RIA基本試劑 27 標(biāo)準(zhǔn)抗原的要求： 標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原、標(biāo)記抗原具有基本相同的免疫活性，即 質(zhì)同 。并且，標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相同。 ?只有保證標(biāo)準(zhǔn)抗原的準(zhǔn)確定量，才能保證 RIA分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精確度。 穩(wěn)定性要好 ： ? 要保證在試劑盒的運(yùn)輸、儲存和在實(shí)驗過程中應(yīng)該不發(fā)生降解，分離、破壞等。 90% 2）半衰期足夠長 3）保持原有抗原的特性 大分子： 125I 小分子： 3H or 125I （二） 標(biāo)記抗原 31 標(biāo)記抗原的要求 質(zhì)同，即標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原、待測抗原的化學(xué)性質(zhì)和免疫活性要相同。 ? 比活度高則在允許的相同的測量統(tǒng)計誤差的前提下，所使用的標(biāo)記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競爭的待測抗原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。 32 標(biāo)記抗原要有足夠高的放射化學(xué)純度，一般要大于 95%。 ? 由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標(biāo)記抗原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。 ?在標(biāo)記抗原的儲存上，應(yīng)遵循標(biāo)記化合物的保存原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。 ?抗體的質(zhì)量之間關(guān)系到 RIA分析方法的靈敏度和特異性。 ? K值越大，形成抗體抗原復(fù)合物速度快，解離少，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精確度都好。 37 交叉反應(yīng)率： ? 指抗體識別相應(yīng)抗原類似物的能力，反應(yīng)了抗體的特異性 。 ? 交叉反應(yīng)率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉反應(yīng)就越小，其識別抗原類似物的能力就越強(qiáng)，特異性就越強(qiáng)。 ? 即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線，比較兩者在其結(jié)合率為零管（ B/B0）的 50%時的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率，也就是該抗體對被測物某種類似物的相應(yīng)活力。 ? 指在沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原存在的時候，結(jié)合 50%的標(biāo)記抗原時抗血清的稀釋度。 40 三、 RIA的分離方法 ?指分離標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（ B）和游離標(biāo)記抗原（ F）的方法。 ② 特異性分離方法：利用免疫反應(yīng)的特異性來進(jìn)行分離的方法如雙抗體法等。 ?不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過程中不使抗原 抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。 ?操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。 ?常用的表面活性物質(zhì)是葡聚糖凝膠和活性碳顆粒。 常用 。 ?在溶液中加入一定量的沉淀劑如聚乙二醇，乙醇等可以破壞大分子的水包膜，使大分子互相靠攏，形成更大的分子而沉淀下來。 此法特異、高效、非特異結(jié)合低、重復(fù)性好。 47 磁性微粒分離技術(shù) ? 是一種新興的分離技術(shù)。 48 ? 使用時磁性微粒經(jīng)過特異性抗體包被制成的免疫磁性微粒以懸浮液狀態(tài)存在于反應(yīng)溶液中，在反應(yīng)中與抗原結(jié)合形成復(fù)合體后，當(dāng)受外加磁場吸引的作用磁性微?？煽焖俪两刀孕蟹蛛x，無需離心沉淀，因而使操作過程大為簡化。 50 四、測量儀器 ?1. γ射線探測器（ γ免疫計數(shù)器） ： γ射線 ? (liquid scintillation counter) ： β 射線 51 五、 RIA的優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高： 一般化學(xué)分析法的檢出極限為 103～ 106g，而 RIA通常為 109(ng)、 1012(pg)，甚至 1015 (fg)、 1018 (ag) 52 特異性強(qiáng)： RIA是基于抗原抗體免疫結(jié)合反應(yīng)，由于抗原 —抗體免疫反應(yīng)專一性強(qiáng)。 被測物 抗原 53 應(yīng)用范圍廣： ? 據(jù)不完全統(tǒng)計，目前至少已有 300多種生物活性物質(zhì)已建立了 RIA。 ? 近年來由于小分子半抗原制備抗體的技術(shù)有很大的發(fā)展，有人預(yù)測幾乎所有的生物活性物質(zhì)，只要其含量不低于 RIA的探測極限，都可建立適當(dāng)?shù)?RIA法。 ? 操作簡便，成本低。 55 六、 RIA的質(zhì)量控制 ? 一個理想的、沒有誤差的“完美”測定，應(yīng)該是標(biāo)本樣品的分析物無論是在一次測定中的任何位置，無論是重復(fù)測定幾次，甚至在不同實(shí)驗室所測得的結(jié)果都是一樣的，而且所測值就是這個樣品的真值。 任何一種分析方法都會產(chǎn)生誤差。 實(shí)驗室應(yīng)該有嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。 57 （一）誤差的分類和來源： 根據(jù)來源不同的誤差，可以把實(shí)驗中產(chǎn)生的誤差分為兩類： ?系統(tǒng)誤差 ?隨機(jī)誤差 58