多聚酶鏈式反應擴增dna片斷-在線瀏覽
2025-07-13 06:19本頁面
【正文】 切掉引物。形成一條完整的新的 DNA鏈。一般 GC含量每增加 1%，解鏈溫度增加 ℃ 。 DNA。在一般 PCR中，變性溫度為 90～ 95℃ ，加熱時間 1～ 2min. PCR原理 ② 當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的 DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈 ③ PCR利用了 DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的 PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致 DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的 Taq DNA聚合酶解決了高溫導致 DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化。 PCR技術(shù)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離， 使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合， 為下輪反應作準備 循環(huán)過程 靶序列 靶序列 PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性 ② 復性（退火） 模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到 500C左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合 PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火 ③ 延伸 DNA模板－引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的 DNA鏈 PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸 第 1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列 30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量 循環(huán) 次數(shù) DNA數(shù)量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 PCR 循環(huán)的結(jié)果 ② DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的 DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增 ① 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，并且由引物 Ⅰ 延伸而成的 DNA單鏈會與引物 Ⅱ 結(jié)合，進行 DNA的延伸 PCR反應條件： ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境 ② DNA模板 ③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 ④ A、 T、 G、 C四種脫氧核苷酸 ⑤耐熱的 DNA聚合酶，一般用 TaqDNA聚合酶 ⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設(shè)備 二、 PCR 的實驗操作 PCR儀 （一）設(shè)備及用具 實質(zhì)上一臺能夠 自動調(diào)控溫度 的儀器 微量離心管 一種 薄壁塑料管 ，總?cè)莘e為 微量移液器 用于 定量轉(zhuǎn)移 PCR配方中的 液體， 其上 的一次性吸液槍頭用一次更換一次 PCR儀 微量移液器 微 量 離 心 管 離心管 準備 移液 （二）實驗操作步驟 按照 PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上 用微量移液器按照 PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑 ① 過程： 蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 ② 注意： 混合 B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻 A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防
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