new實(shí)驗(yàn)七gst酶親和層析及sds-page-在線瀏覽
2025-07-12 22:58本頁面
【正文】 有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、 DNA和 RNA、激素和其受體、 DNA與結(jié)合蛋白等。例如，酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。配基必須偶聯(lián)于不溶性 母體 (matrix) (又稱載體或 擔(dān)體 )上，常用的載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。為此通常在載體和配基之間接入不同長度的 連接臂 (space arm)。將混合菌體蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠 （ GluAgarose beads）孵育，凝膠手臂上的 Glu可以與 GST蛋白特異性結(jié)合，通過洗脫除去不能與珠結(jié)合的雜蛋白而獲得瓊脂糖珠結(jié)合的 GST純蛋白。 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 20 操作步驟 一、細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng) ⑴ 取一支凍存的 B菌，無菌條件下解凍后取 20μl放入 20ml含氨芐青霉素（ Amp， 100 ug/ml）的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜。 ⑶ 將菌液每 34ml/管收集在 Ep管中，離心后棄上清。（留存 10μl上清于一新 Ep管中做對照） ⑵ 將收集的剩余上清直接放入含有 50μl 50% GluAragrose beads的 EP管中，混勻管內(nèi)液體，振搖反應(yīng) 5min后， 2022g離心 1min，然后小心去除珠子上方的上清溶液。最后將珠子上方的溶液盡量吸干凈，注意操作中盡量避免珠子被溶液帶走。（回收含有珠子的 Ep管） Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 22 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）鑒定蛋白質(zhì) ? 常規(guī) PAGE ? 不連續(xù) PAGE ? SDSPAGE ? 固相 pH梯度 IEF(IPGIEF) ? 雙向電泳 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 23 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn) ?聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。 ?機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，有利于電泳后進(jìn)行各種處理。 ?設(shè)備簡單，所需樣品量少，分辨率高。 ?光聚合 核黃素 B1 還原型 游離基 聚合反應(yīng) 光照 O2 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 25 聚丙烯酰胺凝膠的合成 丙稀酰胺 聚丙烯酰胺凝膠 催化劑 聚合反應(yīng) Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 26 單體丙烯酰胺 Acr 交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺 Bis 化學(xué)聚合 光聚合 引發(fā)劑 （ NH4)2S2O8 （ NH4)2S2O8 核 黃 素 加速劑 TEMED DMAPN TEMED 注：（ NH4)2S2O8 過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng) TEMED N， N， N?， N?四甲基乙二胺 DMAPN β－二甲基胺基丙晴 聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲撐橋連接而成的 三維網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)物質(zhì) Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 27 凝膠的孔徑 單體和雙體在凝膠中的總濃度 a+b V 100% T＝ 雙體占總濃度的百分含量，即交聯(lián)度 b a＋ b 100% C＝ a， Acr的質(zhì)量（ g） b， Bis的質(zhì)量（ g） V，溶液的體積（ ml） C＝ ％ T： 5％～ 20％ 孔徑大小 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 28 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍 (kD) 適用的凝膠濃度（ T%） ＜ 10 20－ 30 10－ 40 15－ 20 40－ 100 10－ 15 100－ 500 5－ 10 ＞ 500 2— 5
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