【正文】 PAP,APAAP） ， 再 通過橋抗體與一抗相連 。 固定劑的種類： ⑴ 醛類固定劑： 10%的中性福爾馬林 、 4%多聚甲醛磷酸緩沖液 ⑵ 非醛類固定劑： 丙酮 Carnoy氏液 ， 一 、 免疫酶組織化學(xué)染色法 （ 一 ） 、 酶標(biāo)抗體法 1． 原理：酶標(biāo)抗體染色分為直接法和間接法 直接法： 將酶標(biāo)記在第一抗體上 ， 直接檢測細(xì)胞和組織內(nèi)特異性抗原 。 （ 圖 ） 組織抗原 抗體 標(biāo)記物 直接標(biāo)記法 間接法： 所用的第一抗體是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體 ， 第二抗體是第一抗體的抗體 ， 并且已用酶標(biāo)記 。 第二抗體與第一抗體必須是不同種屬動物制備的 ， 因第二抗體往往是用第一種動物的 IgG所制備 ， 否則就不能檢測出不同特異性抗原的存在 。 反應(yīng)原理如下： HRP: HRP 與 底 物 過 氧 化 氫 和 DAB(3,3’diaminobenzidine,二氨基聯(lián)苯胺 )作用反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色 。 由于抗生素分子有 4個相同的亞基 ， 是生物素的結(jié)合位點(diǎn) ， 這樣它就可以同時與帶有生物素分子的大多數(shù)蛋白質(zhì)相結(jié)合 （ 包括抗體和酶 ） ， 使抗生素和生物素標(biāo)記的酶之間形成大分子復(fù)合物 ， 如 ABC， 而在這個巨大復(fù)合物中的過氧化酶活性并不受影響 。 親和素 生物素 辣根過氧化物酶 生物素標(biāo)記的二抗 ABC復(fù)合物 組織上的一抗 ABC過氧化物酶法 生物素 抗生物素系統(tǒng)用于免疫組織化學(xué)檢測的主要有兩種： — 生物素技術(shù) (labeled avidinbiotin technique, LAB)， 即以生物素標(biāo)記第一抗體 ， 酶標(biāo)抗生物素作為第二抗體 ， 利用生物素 — 抗生物素的親和結(jié)合 ， 以顯示被檢測的抗原； b. 橋式抗生物素 生物素技術(shù) （ bridged avidinbiotin technique, BRAB） ,使用生物素分別標(biāo)記抗體和酶 ， 然后以抗生物素為橋 ， 把兩者連接起來 ， 以顯示被檢測的抗原 。 原理： IGS法是 在特異性抗體與抗原結(jié)合后 ， 再用金標(biāo)記的間接抗體或金標(biāo)記的葡萄球菌 A蛋白與特異性抗體 Fc段結(jié)合 。 IGSS原理 通過抗原抗體反應(yīng)沉淀在抗原位置的膠體金顆粒 ， 可吸附大量的還原銀原子 ， 并在金顆粒周圍形成一個“ 銀殼 ” ， 在抗原存在的部位成黑褐色 。 五 、 雙重或多重免疫染色法 是在同一張組織切片上同時進(jìn)行或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分 。 膠體鐵顯示淋巴細(xì)胞的粘多糖 免疫熒光染色 染色對照與非特異性染色 一 、 染色對照 免疫組織化學(xué)必須設(shè)對照組 ， 包括陽性對照和陰性對照 。 每一批試驗(yàn) ， 每一個濃度都必須作陽性對照 。 陰性對照 陰性對照亦是不可缺少的環(huán)節(jié) 。 如果再出現(xiàn)陽性說明抗體不純 。 既先將未標(biāo)記的第一抗體滴加在組織切片上進(jìn)行充分反應(yīng) ， 再用標(biāo)記的第一抗體滴加同一組織切片上進(jìn)行第二次免疫染色 ， 結(jié)果為陰性或明顯減弱 。 未標(biāo)記抗體 標(biāo)記抗體 抑制試驗(yàn) 抗原 二 、 非特異染色及其清除 免疫組織化學(xué)是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)來顯示抗原或抗體的定位 。 非特異性染色的原因很多： ⑴ 可以是靶細(xì)胞 、 組織的內(nèi)在干擾； ⑵ 可以是標(biāo)記物本身的干擾； ⑶ 抗體自身的干擾； ⑷ 抗體與靶細(xì)胞組織相互的干擾； 因此 ， 清除非特異性染色對于提高免疫染色效果和正確評價免疫結(jié)果十分重要 。 所以在染色前應(yīng)進(jìn)行封閉 ， 去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 。 2．能將凋亡和壞死區(qū)分開 瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察 (特別是透射電鏡是區(qū)別凋亡和壞死最可靠的方法 )，Hoechst33342／ PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測， Annexin V／ PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測等。 ， 細(xì)胞極易被二酶消化 。 2． 脫氧核糖核苷酸酶 (DNase) 濃度為 20ul/ml， 以 Hank’s液 (內(nèi)含 Ca2+， Mg2+)配制 ， — 30℃ 存放 。 2． 加 100ul DNase I(終濃度 67ug/ml)， 37 ℃ 溫育 15min， 再加入100ul胰蛋白酶 (終濃度 1． 25mg／ m1)， 37℃ 繼續(xù)溫育 30min。 4． 以 Hank’s液洗滌 23次后 ， 細(xì)胞重懸于 Hank’s液備用 。 凋亡細(xì)胞具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 排斥胎盤蘭染色 壞死細(xì)胞被胎盤蘭染色 壞死細(xì)胞細(xì)胞膜受損，易受酶的消化 二 、 percoll密度梯度離心法 (一 )原理： Percoll是一種密度梯度介質(zhì) ，由聚乙烯吡咯烷酮包裹的 硅膠顆粒組成 ，不粘附細(xì)胞膜 ， 對細(xì)胞無毒性 ， 可形成等滲 、 均一的密度梯度 。 percoll密度梯度離心法 80%90%的凋亡細(xì)胞沉積在底部 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測 壞死組織周圍 有炎性反應(yīng) 核的變化發(fā)生在晚期 以核溶解和消失為主 早期細(xì)胞膜的完 整性既遭到破壞 細(xì)胞壞死 比 較 周圍組織中 無炎性反應(yīng) 核變化發(fā)生在早期以固縮核變化為主 細(xì)胞膜一直保持完整性 細(xì)胞凋亡 根據(jù)細(xì)胞凋亡與壞死的形態(tài)學(xué)特征 ， 目前已經(jīng)設(shè)計出許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)研究方法 。 二 、 蘇木素 — 伊紅染色 (HE染色法 ) 1. 石蠟組織切片的 HE染色 （ 略 ） 結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下 細(xì)胞核呈藍(lán)黑色 ， 胞漿呈淡紅色 。 壞死組織則呈勻質(zhì)紅染的無結(jié)構(gòu)物質(zhì) ， 核染色消失 。 HE染色的凋亡細(xì)胞 HE染色細(xì)胞調(diào)亡 HL60細(xì)胞 50μmol/L表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（ etoposide)處理 6小時后，出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞（ A),少量的活細(xì)胞 (L)，一些壞死細(xì)胞（ N)。 ? 而細(xì)胞壞死則是一種被動的細(xì)胞死亡過程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有 RNA的損失。 光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞固縮，細(xì)胞核呈綠色或綠藍(lán)色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染，壞死細(xì)胞只有固縮細(xì)胞核呈綠色著染。 五、瑞氏 (Wright)染色 電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 透射顯微鏡觀察方法 透射電鏡是觀察細(xì)胞凋亡最可靠的方法 ，凋亡細(xì)胞在透射電鏡下其形態(tài)學(xué)改變具有特征性 。 熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞 原理一： 熒光素 (fluorochrome)是一種染料，它可以吸收激發(fā)光的光能和發(fā)射熒光。 原理二： 許多熒光化合物可嵌入 DNA分子或以靜電相互作用與 DNA分子結(jié)合 ，可用作細(xì)胞 DNA的熒光探針 。 5′溴脫氧尿嘧啶核苷誘導(dǎo) MKN45 細(xì)胞凋亡核 DAPI熒光染色 BrdU 標(biāo)記法顯示細(xì)胞凋亡 常用的熒光染色方法 吖啶橙的熒光隨 pH而變 ， 其正色為 綠色 ，隨 pH下降可變到 橙紅色 。 第二復(fù)合物在多核苷酸表面 ，由吖啶橙與磷酸鹽基團(tuán)連接而成 。 1． 吖啶橙染色法 （ 1） ． 試劑及配制 吖啶橙貯存液： 10mg吖啶橙溶解于 100ml PBS中 ， pH4． 8— 6． 0濾過 ，4℃ 避光保存 。 ② 取 95181。l的吖啶橙貯存液混勻 。 結(jié)果判斷 : 在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核 DNA為黃色或黃綠色均勻熒光 ，細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃或桔紅色熒光。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失?；罴?xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色；凋亡細(xì)胞凝集的染色質(zhì)呈現(xiàn)黃色的斑點(diǎn)；凋亡細(xì)胞由于失去膜的整合性，與溴化乙錠共染時呈現(xiàn)橙色。因此 ， 染色 DNA時 ， 應(yīng)調(diào)整染液的 pH直至 。 用時蒸餾水 10倍稀釋成染色液 。 ③ 封片液 (pH5 ． 5) ： 20mmol ／ L 檸檬酸 ，50mmol／ L磷酸氫二鈉 ， 50％ 甘油 。 ⑶ 結(jié)果判斷 在熒光顯微鏡下 ， 活細(xì)胞核呈彌散 、 微弱 、 均勻熒光 ， 出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時 ， 胞核或胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的 顆粒塊狀熒光(藍(lán)色 )及明顯核形態(tài)變化 ， 如果見到 3個或 3個以上的 DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞 。正常細(xì)胞核均勻著色，凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)凝聚及核裂解其核著色不規(guī)則。 超速離心不僅能分離純化 DNA、 區(qū)分開環(huán)和閉環(huán) DNA， 而且也可以用于凋亡細(xì)胞染色質(zhì) DNA的片段化檢測 。直接用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶進(jìn)行染色，可以確定DNA在凝膠中的位置。 (7)置液氮 510min， 12022r／ min離心 10min沉淀 DNA， 去上清 ， 真空抽干或風(fēng)扇下吹干殘存液體 。l TE緩沖液 ， 另加 5181。 (9)取 20181。l上樣 ， 1％ 瓊脂糖凝膠電泳 (電壓 50V， 1． 52h)， UV下觀察 。 結(jié)果判定： ★ 正?；罴?xì)胞 DNA基因組條帶由于分子量大，遷移距離短，所以停留在加樣孔附近。 原位末端標(biāo)記技術(shù)原理 原位末端標(biāo)記 (in situ end— labeling，ISEL)是將 摻入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸 在酶如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)、 DNA聚合酶 I或 Klenow大片段等的催化下 與凋亡細(xì)胞 (因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生 )的單股或雙股斷鏈相結(jié)合， 再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。 用辣根過氧化酶 +底物 DAB來顯示； 生物標(biāo)記 通常有兩種方法 ： ① 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移 酶介導(dǎo)的 dUTP缺口 末 端 標(biāo) 記 (terminal deoxynucleotidyl transferase— mediated dUTP nick end labeling)， 簡稱 TUNEL； ② DNA聚合酶 I或 Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移 (in situ nick translatin)簡稱INST。 常用的標(biāo)記物和顯示系統(tǒng)有： 生物素標(biāo)記的 dUTP(biotin— dUTP)，其相應(yīng)的顯示系統(tǒng)為 卵白素 (avidin)或鏈卵白素(streptavidin)標(biāo)記的 辣根過氧化物酶 (HRP)和顯色底物 DAB； 地高辛 (digoxigenin)標(biāo)記的dUTP(digoxigenin— dUTP)，顯示系統(tǒng)為 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體 (正常羊 IgC的Fab片段 )和 DAB； 熒光素標(biāo)記的 dUTP(常用 F1TC— dUTP)， 用流式細(xì)胞儀 分析或在熒光顯微鏡下觀察。 TUNEL和 ISNT鑒定標(biāo)記的陽性細(xì)胞可結(jié)合下列標(biāo)準(zhǔn)加以判斷： 單個或少數(shù)幾個孤立地分布在組織中；具有凋亡細(xì)胞的核特征 ， 即核固縮顯示一個或多個染色體團(tuán)塊 ， 凋亡小體核片段；周圍或局部無炎癥反應(yīng)的征象 。 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的原理 一 、 原理：激光照射單細(xì)胞 ， 其瞬 時產(chǎn)生的散射光和熒光被接受轉(zhuǎn)換成電信號 。 FLS可分析細(xì)胞直徑大小 ，90℃ CLS可分析細(xì)胞表面形態(tài) 、 胞內(nèi)顆粒大小 、 多少及分布狀態(tài) 。 在目前細(xì)胞凋亡的研究中 ， 常使用一些與核DNA結(jié)合的熒光染料 。 * 活細(xì)胞染料如 Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對細(xì)胞沒有太大的細(xì)胞毒作用 。 * 凋 亡細(xì)胞的染色體 DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與 DNA結(jié)合 * 凋亡細(xì)胞膜上的 p— 糖蛋白泵功能受到損傷 ，不能有效地將 Heoehst33342排出細(xì)胞外 ， 使之在細(xì)胞內(nèi)積累 。 壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損 ， 可被這些染料染色 。 通過流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡具有以下特征： ① 由于細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的激活 ， 使 DNA降解 ，DNA特異性熒光染色減少 。 ③ 線粒體仍有膜電位 。 ⑤ 蛋白含量明顯減少 ， 主要是因?yàn)榧?xì)胞的內(nèi)源性蛋白酶被激活 。 ⑥ 凋亡發(fā)生時，前散射光減少，側(cè)散射光不變?nèi)?HL— 60細(xì)胞；或側(cè)散光增加如胸腺細(xì)胞。但有時壞死細(xì)胞中也會出現(xiàn)此特征。 Hoechst 33342 EB、 PI染料不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中 ， 正常細(xì)胞 凋亡細(xì)胞 死細(xì)胞 Hoechst 33342和 PI雙染色 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期特異性 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)不僅可以從細(xì)胞的形態(tài)和特征上鑒別出凋亡細(xì)胞，