【正文】 過植物組織培養(yǎng)來進(jìn)行。（1）植物組織培養(yǎng)是指分離單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或植物體的一部分，在人工配制的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)成一株完整植物體的過程。第1章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)（7學(xué)時(shí)） 第一節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第四節(jié)試管苗的馴化與移載本章小結(jié)目的要求：(1)掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)；(2)掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及其使用方法；(3)掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。在實(shí)際中可結(jié)合可行條件，合并一部分。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，最好是白瓷水槽。上下水道要暢通。備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安裝滅菌用的紫外燈。（四）無菌操作室（transfering room）接種室是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。在工作方便的前提下，接種室宜小不宜大，一般7～8m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架長(zhǎng)度都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，30W的長(zhǎng)lm，寬度一般為60cm。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。控制日光照時(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，一般需要每天光照10～16h也有的需要連續(xù)照明?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。（六）馴化室馴化室要求清潔無菌，配有空調(diào)機(jī)、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)節(jié)裝置、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具（一）儀器設(shè)備（見實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)）1．超凈臺(tái)，優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時(shí)間短。在工廠化生產(chǎn)中，接種工作量很大，需要經(jīng)常長(zhǎng)久地工作時(shí)，超凈臺(tái)是很理想的設(shè)備。超凈空氣的流速為每分鐘24～30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。超凈臺(tái)分水平式和垂直式二種型號(hào)。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來保證內(nèi)部空間無菌。3．空調(diào)機(jī)，保證室內(nèi)溫度，一般為25177。以便于排熱散涼。5．恒溫箱，用于植物材料的培養(yǎng)，可以控制溫度、濕度及光照等。用于干燥需保持80～100℃；進(jìn)行干熱滅菌需保持150℃，達(dá)1～3h；若測(cè)定干物重，則溫度應(yīng)控制在80℃烘干至完全干燥為止。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。通常以電作能源。9．電子分析天平和托盤天平，電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。10．顯微鏡及解剖鏡，種類較多，用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。放大40倍以上操作需要有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。解剖鏡上帶有照相裝置，根據(jù)需要隨時(shí)對(duì)所需材料進(jìn)行攝影記錄。一般在液體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)速為每分鐘100次左右，在解離原生質(zhì)體時(shí)為每分鐘80左右。磁力攪拌器還可加熱，使之更利于溶解。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)基可用自來水來代替，若實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話，則須用蒸餾水。首次使用酸度計(jì)前，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位，然后固定。如果培養(yǎng)基溫度過高，測(cè)量時(shí)要調(diào)整pH值計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。1離心機(jī)，用于收集原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)速要求較低。（二）各類器皿1．培養(yǎng)器皿：在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長(zhǎng)，受光也比試管好。培養(yǎng)皿常用12cm直徑等規(guī)格，要求上、下能密切吻合。 試管常用18mmXl80mm或20mmX200mm規(guī)格。培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。但缺點(diǎn)是易引起污染。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可提高培養(yǎng)空間利用率的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來，從而節(jié)約空間。有些產(chǎn)品為一次性消耗品，不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí)間，提高效率。瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。但這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基的濕度。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。也可采用專用的封口膜。大型實(shí)驗(yàn)室可采用醫(yī)用“下口杯”作為分裝工具，在“下口杯”的下口管上套一段軟膠管，加一彈簧止水夾，使用時(shí)非常合適。3．離心管，用于離心收集原生質(zhì)體，一般用5ml、10ml規(guī)格。用于配制培養(yǎng)基時(shí)吸取不同種類的母液。5．細(xì)菌過濾器，用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細(xì)菌。6．實(shí)驗(yàn)器皿，在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括100ml、250ml、500ml、1000ml燒杯；l0ml、l00ml、1000ml量筒；l00ml、1000ml試劑瓶(棕色)等等。根據(jù)操作需要有各種類型，若用l00ml的三角瓶作為培養(yǎng)瓶，可用20em長(zhǎng)的鑷子。鑷子太長(zhǎng)，使用起來不靈活。2．剪刀類（scissors）可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時(shí)會(huì)造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。也可用于分離微莖尖的幼葉，可以自制。一般為T字型。7．其它包括酒精燈，電爐，試管架，搪瓷盤等多種。培養(yǎng)基（culture medium）是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí)，對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn)，或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展，取得越來越多的成功。1．水水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)39。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。其作用是： (1) N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO，N又含NH4N。供應(yīng)的物質(zhì)有KN0NH4NO3等。(2) P 是磷脂的主要成分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO，等鹽類提供。它們常以MgS04用量為1～3mg／L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2(5) 微量元素 ／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2(S04)3和FeCl3(，易形成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用FeS04B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)，發(fā)育異?，F(xiàn)象。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。不同糖類對(duì)生長(zhǎng)的影響不同。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長(zhǎng)?！疞。Vm對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。(3) 肌醇 (myoinosit0l)又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。(5) 天然復(fù)合物 其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。2) 香蕉 用量為150～200ml/l。對(duì)pH值的緩沖作用大。3) 馬鈴薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。對(duì)pH值緩沖作用也大。4) 水解酪蛋白 為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100～200mg／L。5) 其他 酵母提取液(YE)(％～％)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(％％)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。(1)生長(zhǎng)素類 (auxin) 在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在極低的濃度下，(105～108mg／L)就可促進(jìn)生長(zhǎng)，其次是莖和芽。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。IAA (indoaceticacid，吲哚乙酸) 是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低，是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA (naphthaleneaceticacid，萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3～4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。2，／L的NaOH或KOH助溶。(2) GA (gibberellicacid，赤霉素) 有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長(zhǎng)素／赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)可用少量95％酒精助溶。(3)細(xì)胞分裂素類 (cytokinin) 這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6BA(6芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動(dòng)素)、Zt (zeatin玉米素)等。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素／生長(zhǎng)素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。③抑制根的分化。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、是長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。5．培養(yǎng)材料的支持物(1) 瓊脂 (agar) 在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在6～10g／L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。因此在研究植物組織或細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)問題時(shí)，則應(yīng)避免使用瓊脂。 (2) 其他 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時(shí)間。對(duì)于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5％～10％的抗菌素。但是應(yīng)當(dāng)注意抗生素對(duì)植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用，可能某些植物適宜用青霉素，而另一些植物卻不大適應(yīng)。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來造成的。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長(zhǎng)停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。目前還沒有徹底完善的辦法，只能按不同的實(shí)際情況，加用一些藥物，并適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度、及時(shí)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上等辦法，使之有不同程度的緩解，當(dāng)然像嚴(yán)格選擇外植體部位、加大接種數(shù)量等也應(yīng)一并考慮。其他抗氧化劑有二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5羥甲基糖醛及激素等?；钚蕴吭谏鶗r(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性碳減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長(zhǎng)的IAA，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長(zhǎng)，由于根的生長(zhǎng)加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)了莖、葉