【正文】 的去除 發(fā)酵液中有色物質(zhì)可能是由于微生物生長 代謝過程分泌的 ，也可 能是 培養(yǎng)基 （如糖蜜、玉米漿等）帶來的，色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的多樣性增加了脫色的難度。 細胞分離 大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質(zhì)從發(fā)酵液中除去。濃度可高達每單位體積含 60%的不溶性固體，又可低至每單位體積僅含 %。對于這些濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，我們可以采用過 濾方法分離。與過濾設(shè)備相比，離心設(shè)備的價格昂貴。離心分離是基于固體顆粒和周圍液體 密度 存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程，當靜置懸浮液時，密度較大的固體顆粒在重力作用下逐漸下沉，這一過程稱為沉降。離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。 顆粒的沉降 當一固體微粒通過無限連續(xù)介質(zhì)時，它的運動速度受兩種力的影響： 一是微粒受到因微粒和流體介質(zhì)間密度不同而產(chǎn)生的浮力作用； 二是微粒所受到的流體阻力作用。達到恒定的沉降速度時，合力為 （球形顆粒的自由沉降速度） （ 2）阻力（曳力）系數(shù)（ Drag coefficient） 與流體的流動阻力系數(shù)類似，阻力（曳力）系數(shù)與顆粒沉降雷諾數(shù)有關(guān)，即 注意：其中 d 為顆粒直徑， u0 為顆粒的沉降速度， ρ 、 μ 分別為流體的密度與粘度。 以上的沉降過程為在重力作用下球形顆粒的自由沉降： ① 顆粒為球形； ② 顆粒沉降時彼此相距較遠，互不干擾； ③ 容器壁對沉降的阻滯作用可以忽略； ④ 顆粒直徑不能小到受流體分子運動的影響。 離心沉降 離心力： Stock’s Force(粘滯力 )： 離心沉降速度： 分離因子定義 Fr：離心力 /重力加速度 (g)的比值 意義：衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)，用于離心機的分類 注意：離心沉降與重力沉降的類比。離心沉降速度并不是顆粒的實際運動速度，只是其在徑向上的分量。 Sw,20 與溶質(zhì)（顆粒）濃度有關(guān)： 為 c?0 時的沉降系數(shù) (20 ?C 的水 ), k 為常數(shù) 可以得到溶質(zhì)完全沉降所需的時間： 離心分離法 1） 差速離心分級 2）區(qū)帶離心 （密度梯度離心） ： 差速區(qū)帶離心 、 平衡區(qū)帶離心 離心分離設(shè)備 按分離因子 Fr 分類 1)、常速離心機 Fr 3,000g 三足沉降式 : 5001000g 螺旋卸料式： 12003000g 2)、中速離心機， Fr = 3,000 — 5,000g 多室離心機： 20208000g 碟片式離心機： 300010000g 3)、高速離心機， Fr = 5,000 — 20,000g 多室離心機： 20208000g 碟片式離心機： 300010000g 管式離心機： 800015000g 4)、超速離心機， Fr = 20,000 — 1,000,000g 用途分類 1)、分析性：超速離心機 2)、制備性： A、實驗室用； B、工業(yè)用 工業(yè)應(yīng)用分類 1)、管式離心機 2)、多室離心機（管式離心機的變形） 3)、碟式離心機：Ａ、人工排渣式 , Ｂ、噴嘴排渣式 , Ｃ、活塞排渣式 4)、螺旋卸料沉降離心機 5)、離心過濾 6)、三足式離心機 離心過濾 計算 流量方程： 注： 流量為非常數(shù)，時間增加， 濾餅厚度增加，而流量減小。 過濾介質(zhì) 具有多孔結(jié)構(gòu)，可以截留固體物質(zhì)，而讓液體通過；我們把待過濾的懸浮液成為 濾漿 （ Slurry），而過濾后分離出的固體稱為 濾渣或濾餅 （ Filter cake），通過過濾介質(zhì)的液體稱為 濾液 （ Filtrate）。 工業(yè)上常見的過濾介質(zhì)：織物介質(zhì)、堆積介質(zhì)、多孔固體介質(zhì)、多孔膜。 （ 4）濾餅的可壓縮性 （ 5）助濾劑：助濾劑本身就是一性能良好的過濾介質(zhì)，是一種堅硬、不規(guī)則的小顆粒，它能形成結(jié)構(gòu)疏松、 空隙率大、不可壓縮的濾餅，很大程度改善過濾難度。 過濾速度 過濾過程數(shù)學(xué)描述 達西方程： 適用于不可壓縮和簡單的可壓縮濾餅 普遍使用于生物分離過程 過濾基礎(chǔ)理論 。 Kozeny’ s 方程 對于發(fā)酵液的過濾 ,要用 Kozeny’ s 方程 K’’ = Kozeny’s 常數(shù)，一般 K’’ = 5（在大量均勻的球形顆粒中），其他顆粒 K’’ = ，顆粒 ?， K’’ ?； S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積； ? = 發(fā)酵液黏度 (in: Pa s)； ? = 床層的空隙率，即空隙體積與總體積的比值。 意義：過濾的基礎(chǔ)方程，揭示了過濾流速與各因素的關(guān)系 過濾速度： 濾餅阻力與濾餅干重之間的關(guān)系 : α 為濾餅的平均比阻，不可壓縮性濾餅的α為常數(shù)，可壓縮性濾餅的α為壓差的函數(shù)，經(jīng)驗表達式為： 比阻 (平均質(zhì)量比阻 m/kg)定義式 S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積 ?s：干濾餅的密度 (in kg/m3)。 n 濾餅可壓縮度，當濾餅不可壓縮時， n = 0；對于高度可壓縮濾餅，則 n ? 1。 意義： A、對于可壓縮料液，高壓不一定增加流量 B、比阻與壓力的關(guān)系 隨著過濾操作的進行，濾餅量不斷增加，與濾液體積 Q 之間關(guān)系如下： β =濕濾餅 /干濾餅； cs=干濾餅 /液料 β cs=濕濾餅 /液料； 1 β cs= 濾液 /液料； Q 濾液體積 Q/（ 1 β cs） = 液料體積 ρ LQ/ （ 1 β cs） = 液料質(zhì)量 所以 Ruth’s 方程 在過濾操作中，被截留的固相顆粒在介質(zhì)形成濾餅。過濾流量可表達為 Q：濾液體積 (in m3)， A：過濾面積 (in m2)， ? ＝ 濕濾餅 :干濾餅， cs：料液中干固相成分的濃度 (in: kg/kg)， ?Ｌ：濾液密度， Q0：相當于過濾介質(zhì)阻力時的虛擬濾液體積 (in m3)，一定過濾介質(zhì)的 Q0 為常數(shù)。在一般條件下 Q0 可忽略，上式為： 意義：中試后放大的理論依據(jù) 恒速過濾 恒速條件下對 Ruth’s 方程積分 ： 過濾設(shè)備 過濾設(shè)備從傳統(tǒng)的板框式過濾機到旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備，種類很多。 缺點：Ａ、占地大，單位體積利用率低，Ｂ、周期性中斷進料、濾布利用率 低，Ｃ、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵。 優(yōu)點：Ａ、超大規(guī)模 (400 m2)，極易實行大型化分離，Ｂ、占地小，單位體積利用率高，Ｃ、自動化、操作簡單。 帶式真空過濾器 應(yīng)用：大規(guī)模分離的主要過濾設(shè)備，可分離較難分離的低黏度的發(fā)酵液，對濾餅洗滌要求高。 缺點：Ａ )、占地大，有效過 濾面積低， Ｂ )、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液， Ｃ )、設(shè)備投資高。 優(yōu)點：Ａ、操作壓高０ .１ Mpa 以上， １０％的 顆粒含量，高含量的細顆粒， Ｂ、濾餅含水量低，濾液澄清， Ｃ、自動化、操作簡單，清洗保養(yǎng)容易。 如何選擇過濾器？ 濾液的澄清度 顆粒大小的分布 發(fā)酵液的黏度 固體顆 粒的濃度 濾餅的干燥度 濾餅的洗滌 生產(chǎn)能力 中試實驗設(shè)計的路線 ： 確定生產(chǎn)能力（例： 150T/d） 確定中試實驗的規(guī)模（一般按生產(chǎn)能力縮小 100 倍，即 150/100 = ） 測定重要參數(shù)，如 ?， Q0 等 優(yōu)化實驗條件 確定不同的實驗條件：預(yù)處理、助濾劑、壓力等 濾餅的厚度與時間關(guān)系 濾餅的孔隙率與壓力關(guān)系 不同壓力下濾液的體積與時間的關(guān)系 濾餅的洗滌、脫水、排脫等 濾液的澄清度，以及上述方程要求的數(shù)據(jù)利用方程等 計算： A、過濾面積 A，確定型號 (以恒壓為例 ) 放大 100 倍 生產(chǎn)能力 (= 100A) 結(jié)論： 離心和過濾是去除不溶物的主要方法，生物分離工業(yè)首先要去除不溶物，大的、硬的不溶物可用過濾方法去除， 對于大部分發(fā)酵液，助濾劑或者其它預(yù)處理方法有利于過濾，但也有沒有效果的。 細胞破碎 胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代謝物 細胞本身： 單細胞蛋白（ SCP） 胞內(nèi)產(chǎn)品 :堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細胞產(chǎn)物等 2 . 細胞的結(jié)構(gòu) 細胞壁的組 成和破碎阻力 細菌 ：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 真菌： 多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但研磨產(chǎn)熱，功率 ? ，溫度 ? 。 d) 細胞濃度 x：最佳 x 由實驗確定。通常懸液中細菌細胞質(zhì) 量濃度在 60120g/L、酵母細胞質(zhì)量濃度在 14010g/L 時破碎效果較理想 e) 破碎效率： f) 流量 Q：破碎為一級反應(yīng)。 2)、液體剪切法 (最常用的方法之一 ) 影響因素： 操作壓力 p： p?, R? 。溫度 ? 2?C /10MPa 。 溫度：比速度 k 與溫度有關(guān)，溫度 ?25?C， k? 倍。 細胞種類：影響 k 值。 B、高壓勻漿機最適合于酵母和細菌 。 4) 超聲破碎法 (15—25kHz) ? 超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的 1525kHz 的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為 槽式 和 探頭直接插入介質(zhì) 兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。 優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎 缺點： A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀； B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用； C、有效能量的利用率低； D、產(chǎn)熱大，需控溫； E、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。 優(yōu)點： A、產(chǎn)品釋放的選擇性； B、提取速度和收效高； C、產(chǎn)品的破壞小； D、對外界環(huán)境，如 pH 和溫度等要求低； E、不殘留細胞碎片。溶菌酶（ lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時，需輔以 EDTA 使之更有效地作用于細胞壁。 ? 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶?？墒?，改變其生長環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。堿和表面活性劑能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。非離子型如 Triton X100 和吐溫（ Tween）等 ? 有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 物理滲透法 滲透壓沖擊法 ? 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。 機械法和化學(xué)法的比較 機械破碎法缺點： A、高能、高溫、高噪音、高剪切力 (四高 )，易使產(chǎn)品變性失活； B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難； C、細胞碎片大小不一，難分離。 破碎方法的選擇 選擇的一般原則： A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎 B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學(xué)法 C、提取產(chǎn)物與細胞膜和細胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法 破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問題： A、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化 C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度的影響 D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物 ? 胞外產(chǎn)物 細胞破碎的評價 直接計數(shù)法 方法：樣本稀釋 染色 上樣 計數(shù)。 優(yōu)點：方法簡單。 間接計數(shù)法 方法：樣本離心 取上清液 測特定蛋白質(zhì)或酶 與理論的最大值比較。 優(yōu)點： A、方法客觀可靠，尤其對蛋白質(zhì)和酶， B、有多種選擇的指標，胞內(nèi)位置 (如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等 )，靈活性大。 解決辦法：篩選相對穩(wěn)定和恒定的指 標。一般靠近細胞壁和細胞膜的酶釋放速度快，而細胞內(nèi)部或細胞器內(nèi)的酶隨破碎的進行緩慢釋放出來。 選擇性釋放目標產(chǎn)物的一般原則 ⑴僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍 當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。同時，溶液性質(zhì)應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出。 第三章 初級分離 6 沉淀分級 沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低、由液相變成固相析出生成固體凝聚物的現(xiàn)象。沉淀具有濃縮與分離的雙重作用。 區(qū)別： 結(jié)晶為同類分子或離子以 有規(guī)則 排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。 缺點： A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，