dnaextraction法醫(yī)學(xué)-在線瀏覽
2025-03-08 07:48本頁面
【正文】 酚的變性作用很強(qiáng) ， 但與水有一定的互溶 ， 這部水溶液中的 DNA就會(huì)丟失 。 所以抽提過程中酚與氯仿混合使用 。 ? 氯仿與酚是互溶的 ， 酚 /氯抽提后 ， 單獨(dú)用氯仿再抽取一次 ， 以去除殘留的酚 。 ? 酚是酸性的 ， DNA可溶于酸性有機(jī)溶劑 ， 因此 ，酚在使用前必須用 TrisHCl()飽和 ，使其 pH值在 。 pH8時(shí) ， DNA更易進(jìn)入水相中 ， 并防止酸性酚溶解 DNA。這種酚可以在 4℃ 保存一段時(shí)間。 8羥基喹啉不僅具有抗氧化作用，而且是一種指示劑。 ? 異戊醇的作用是降低分子的表面張力，減少混合過程中泡沫的發(fā)生，使有機(jī)相和水相充分作用。 SDS的作用 ? SDS是一種去垢劑，它可以破壞細(xì)胞膜，解聚核蛋白，使蛋白質(zhì)變性。 TE等緩沖液中含有 EDTA， EDTA是一種螯合劑，可以螯合 Ca2+、 Mg2+等離子，這些離子是核酸酶具有活性所必須的輔基。 乙醇的作用 ? 乙醇主要用來沉淀 DNA。 使用時(shí)一般加入DNA溶液 2倍體積的無水乙醇 ， 使其終濃度為67%左右 。 ? 沉淀出來的 DNA要用 70%的乙醇洗滌 ， 其目的是洗去一些離子 ， 以防止這些離子對(duì)以后實(shí)驗(yàn)的影響 。 PK的使用終濃度一般為100?g~20mg/ml。這些常含有抑制 PCR的物質(zhì)。 ? 2． 為了去除有抑制物 ， 用有機(jī)溶劑抽提之后 ， 要用 Centricon 100或 Microcon 100進(jìn)行透析和濃縮 ， 因此有機(jī)法的 DNA提取過程比較復(fù)雜 ， 也比較耗時(shí) 。 ? 4． 損失部分 DNA。 ORGANIC DNA EXTRACTION ? PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) ? RFLP or PCR ? YIELDS HIGH MOLECULAR WEIGHT DNA (HMW DNA) ? TIME CONSUMING ? HAZARDOUS CHEMICALS ? MULTIPLE TRANSFERS (possible errors) 鹽析法 ? 往 DNA溶液中加入 NaAc或 NaCl， 使溶液中的離子發(fā)生， DNA所帶的電荷隨之發(fā)生改變， DNA析出。 Chelex法 ? Chelex是一種螯合離子交換樹脂， 1991年 Walsh等人用 Chelex 100處理法醫(yī)學(xué)檢材，發(fā)現(xiàn)用它提取 DNA非常適合于用 PCR的擴(kuò)增，從此成為法醫(yī)學(xué)上最常用的 DNA提取方法。 Chelex可以螯合銅、鐵及其他重金屬離子包括鈉、鉀等單價(jià)陽離子，對(duì)二個(gè)離子的親和力特別強(qiáng)。 Chelex 100不會(huì)改變非金屬離子的濃度 。 在高溫和低離子強(qiáng)度的條件下 ， 金屬離子是 DNA斷裂的催化劑 。 ? Chelex 100具有堿性 ， 在 100℃ 條件下 ， 細(xì)胞膜被破壞 ， DNA發(fā)生變性而釋放出來 。 ? 除了金屬離子以外， Chelex 100可能還結(jié)合了其他一些 PCR抑制劑，如亞鐵血紅素或其衍生物。 ? 加入用無菌去離子 H2O水制備的 5 %( w/v)的Chelex100 懸液 200?l， 振蕩 ， 重懸沉淀 。 ? 水浴中煮 8 min， 或在 PCR儀中 99℃ 10 min。 ? 取上清進(jìn)行 DNA定量和 PCR擴(kuò)增。 ? 2． 提取過程在一個(gè)管內(nèi)完成 ， 避免污染 ，減少操作上所致的失誤 。 ? 4． 所需的檢材量少 。 Chelex100法的缺點(diǎn) ? 1． 處理的檢材量不能太多 ， 只適用于提取少量的 DNA。 ? 3．提取的是單鏈 DNA， 不能用來做RFLP分析。 ? 2． 吸取 Chelex 100懸液的吸頭的孔徑要比較大 ， 必要時(shí)可剪去一部分 ， 以保證吸到的是 5%懸液 。 組織和骨頭則不需要洗滌這一步 。 要確定是否有擴(kuò)增抑制物 ， 可以取部分檢材的提取液加入已知陽性對(duì)照的反應(yīng)中 ， 觀察擴(kuò)增是否受到抑制 。 ? 6． 每批新的 Chelex 100都要進(jìn)行測(cè)試 。 如果有擴(kuò)增產(chǎn)物 ， 分型結(jié)果理想 ， 說明該 Chelex 100沒有抑制物 。Chelex 100在水中幾個(gè)小時(shí)后的螯合能力就會(huì)逐漸下降 。 ? 9． Chelex 100提取所得的是單鏈 DNA，不適宜用插入染色劑 （ 如溴乙錠 ） 的方法來定量 。 Chelex 100樹脂在過了一段時(shí)間后會(huì)變質(zhì)降解，原來結(jié)合在樹脂上的抑制物就會(huì)釋放出來，樹脂本身也會(huì)螯合鎂離子而抑制 PCR。 FTA paper method ? 將血液滴于 FTA卡上，或?qū)⒖谇皇米油坑?FTA卡上，晾干。 ? 用 FTA卡緩沖液洗兩次 ? 用純水洗兩次，干燥 ? 直接往 PCR管中加入 PCR反應(yīng)試劑作 PCR擴(kuò)增。 Other PCR Inhibitors ? Add “PUNCH” DIRECTLY to PCR reaction FTA? PAPER EXTRACTION ? NO QUANTITATION needed – Consistent amount of sample – Consistent results ? AUTOMATION possible ? “Punch” may be REUSED for other tests 硅 (磁 )珠粒吸附法 ? 原理： – 在一定條件下 (如高濃度的硫氰酸胍） ,DNA能夠被二氧化硅或磁珠特異性地吸附
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