【正文】 177。 ? ④ 中和法 凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。 ? (2) 稀釋 (10倍遞增稀釋法 ) 取 2～ 3支滅菌試管，分別加入 9mL稀釋劑，并取 1支 1mL滅菌吸量管吸取 1∶ 10均勻供試液 1mL，加入已備妥的裝有 9mL滅菌稀釋劑的試管中，混勻即成 1∶ 100的供試液。 一、平皿法 o 5．細菌總數(shù)計數(shù) ? (3) 吸樣 根據(jù)供試品污染程度，分別取連續(xù)三級 10倍稀釋的供試液，一般取 1∶ l∶ 100、 l∶ 1 000三級稀釋液檢驗。另取 1支 1mL吸量管吸取稀釋劑各 1mL注入 2個平皿中，作為陰性對照，應(yīng)不得有菌生長。 ? (4) 傾注培養(yǎng)基 事先將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基熔化，冷至低于45℃ 時，注入上述各平皿，每皿 15～ 20mL，快速轉(zhuǎn)動平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。 ? (6) 菌落計數(shù) 由于細菌種類繁多，形成的菌落大小、形狀、色澤、透明度等皆因種而異，差別甚大。不要漏計瓊脂層內(nèi)和平板邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與藥渣或培養(yǎng)基的沉淀物、酵母菌及霉菌菌落的區(qū)別。當(dāng)比值大于 5時，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)重新驗證；各稀釋級平均菌落數(shù)均不足 30時，以最低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)為報告菌數(shù)；如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于 1時，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)的值為報告菌數(shù)。該培養(yǎng)基更適合于酵母菌生長，故 《 中國藥典 》 規(guī)定含有王漿、蜂蜜的合劑用它測定酵母菌數(shù)。 一、平皿法 ? 6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計數(shù) ? (2) 操作方法 ? 霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細菌數(shù)測定同時進行，按規(guī)定取 2個以上包裝的供試品。 ? ② 稀釋 (10倍遞增稀釋法 ) 取 2～ 3支滅菌試管，分別加入9mL稀釋劑，并取 1支 1mL滅菌吸量管吸取 1∶ 10均勻供試液1mL，加入已備妥的裝有 9mL滅菌稀釋劑的試管中，混勻即成1∶ 100的供試液。 一、平皿法 ? 6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計數(shù) ? (2) 操作方法 ? 霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細菌數(shù)測定同時進行，按規(guī)定取 2個以上包裝的供試品。每級稀釋液用 1mL滅菌吸量管吸取稀釋液，分別注入 2～ 3個平皿各 1mL。操作時，應(yīng)特別注意每次吸液前必須使稀釋液充分混勻，以使菌體充分均勻分散，降低測定誤差。 ? ④ 傾注培養(yǎng)基 事先將玫瑰紅鈉培養(yǎng)基熔化，冷至低于45℃ 時，注入上述各平皿。 ? ⑤ 培養(yǎng) 將已凝固的平板倒置，放入 23～ 28℃ 培養(yǎng)箱 (室 )中，培養(yǎng) 72h，必要時可適當(dāng)延長時間至 5～ 7天。 ? ⑥ 菌落計數(shù) 一般在平板背面用肉眼直接點數(shù)，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。 一、平皿法 ? 6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計數(shù) ? (2) 操作方法 ? 霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細菌數(shù)測定同時進行，按規(guī)定取 2個以上包裝的供試品。當(dāng)比值 ≤2時，以 2級菌落數(shù)的平均值為報告菌落數(shù)；比值大于 2但不超過 5時，按低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)；當(dāng)比值大于 5時，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)重新驗證；各稀釋級平均菌落數(shù)均不足 30時，以最低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)為報告菌數(shù)；如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于 l時，以小于 1乘以最低稀釋倍數(shù)的值為報告菌數(shù)。 ? ⑧ 復(fù)試 供試品檢測霉菌 (酵母菌 ) 數(shù)不合格的，應(yīng)從同一批號樣品中隨機雙倍量抽 ? 樣，平行復(fù)試 2次，取 3次測定數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值報告。 一、平皿法 ? 7． 原始記錄 （ 詳見附錄四 ） 。過濾后，若需用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為 100mL。用 菌氯化鈉 蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。 二、薄膜過濾法 ? 陰性對照試驗：取試驗用的稀釋液 1mL，按照上述濾膜過濾法操作，作為陰性對照，陰性對照不得長菌。 ? 菌數(shù)報告規(guī)則：以相當(dāng)于 1g或 1mL供試品的菌落報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以小于 1報告菌數(shù) (每張濾膜過濾 1g或 1mL供試品 )，或小于 1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。無菌檢查法應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10 000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。 ? (2) 滅菌器材 玻璃器皿：試管、錐形瓶、量筒、量杯、載玻片、刻度吸管 (1mL， 2mL， 5mL， 10mL)、注射器注(2mL， 5mL， 10mL)、培養(yǎng)皿 (直徑 90mm)、輸液瓶、酒精燈等。 ? 無菌衣、褲、帽、罩、鞋。 ? (3) 消毒器材 2．試劑 ? (1) 消毒劑 %苯扎溴銨溶液、 75%乙醇溶液 (制酒精棉球用 )、 3%～ 5%甲酚溶液、 5%甲醛、 0 1%高錳酸鉀等。 ? (3) 滅活劑 無菌青霉素酶溶液。 ? (5) 蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、 L胱氨酸、硫乙醇酸鈉 (或硫乙醇酸 )、胰酶水解酪胨、刃天青 (或亞甲藍 )、瓊脂、 2moL/L鹽酸溶液、 2moL/L氫氧化鈉溶液等。 ? 金黃色葡萄球菌 (Staphylococc181。s subtilis) [ CMCC (B)63501] ? 生孢梭菌 (Clostridi181。 ? 配制方法 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié) pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié) pH使滅菌后為 177。在供試品接種前，培養(yǎng)基指示劑氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度約 l/5，否則，須經(jīng) 100℃ 水浴加熱至粉紅色消失 (不超過20min)，迅速冷卻，只限加熱 1次，并應(yīng)防止被污染。 3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查 ? (2) 培養(yǎng)基的配制 ? ② 改良馬丁培養(yǎng)基 (用于培養(yǎng)真菌 ) ? 培養(yǎng)基配方 胨 、酵母浸出粉 、葡萄糖 、磷酸氯二鉀 、硫酸鐵 、水 l 000mL。 ，分裝，滅菌。 3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查 ? (2) 培養(yǎng)基的配制 ? ③ 選擇性培養(yǎng)基 按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑，如對氨基苯甲酸 (用于磺胺類供試品 )、聚山梨酯 80 (用于非水溶性供試品 ) 或 β內(nèi)酰胺酶 (用于 β內(nèi)酰胺酶類供試品 ) 等。 3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查 ? (2) 培養(yǎng)基的配制 ? ④ 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 取 、 鈉、牛肉浸出粉 、水 1 000mL混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié) pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié) pH使滅菌后為 177。 ? ⑤營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 按上述培養(yǎng)基的處方及制法，加入 ，調(diào)節(jié) pH使滅菌后為177。 3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查 ? (2) 培養(yǎng)基的配制 ? 上述培養(yǎng)基分別按 15mL與 40mL或需要量分裝于試管或其他容器中，裝量約為試管或容器高度的 2/5，以免滅菌時溢出。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在 2～ 25℃ 、避光的環(huán)境。 3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查 ? (3) 培養(yǎng)基適用性檢查 ? ① 無菌性檢查 制備好的每批培養(yǎng)基隨機取不少于 5支 (瓶 )，培養(yǎng) 14天，應(yīng)無菌生長。 4．陽性對照試驗及陰性對照試驗 ? (1) 陽性對照試驗 《 中國藥典 》 2022年版規(guī)定無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品以白色念珠菌為對照菌，加菌量小于 100 CFU。 ? (2) 陰性對照試驗 進行供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照，不得有菌生長。在操作過程中要用 75%酒精擦手套。紫外燈開到 45min時打開層流，當(dāng)紫外燈開夠 1h，關(guān)閉超凈工作臺和緩沖間的紫外燈。 ? (4) 洗滌物品、用具。 6．檢查方法 ? (1) 薄膜過濾法 ? ① 過濾 按規(guī)定量取供試品，按該樣品項下規(guī)定的方法處理后，對于無菌粉針劑和粉末原料應(yīng)用稀釋劑溶解到至少 100mL具塞的瓶中，混勻。 ? ② 沖洗 用沖洗液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜多次，以洗去抗菌物質(zhì)。 6．檢查方法 ? (1) 薄膜過濾法 ? ③ 接種培養(yǎng) 將好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基及陽性對照用培養(yǎng)基分別加至薄膜過濾器內(nèi) (封閉式過濾器 )；或取出薄膜分成 3等份，分別加入好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基，真菌培