【正文】 膠孔徑 ↓ ，所受阻力 ?，機(jī)械強(qiáng)度 ? ? 丙稀酰胺濃度 分離物質(zhì)分子量 4％ 大于 100萬(wàn) 7－ ％ 1－ 100萬(wàn) 15－ 30％ 小于 1萬(wàn) ? 膠的孔徑為蛋白質(zhì)分子平均大小一半時(shí)效果好 ? 凝膠強(qiáng)度的選擇 先用 %的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或 4%10%的凝膠梯度測(cè)試 五 .聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理 ? pH、離子種類和離子強(qiáng)度 酸性蛋白質(zhì) 高 pH 堿性蛋白質(zhì) 低 pH ? 連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng) 電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和 pH 與凝膠相同 電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和 pH 與凝膠相同，分辨率高 （ 1） 盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的四個(gè)不連續(xù)性 ? 濃縮膠 T=％ C=20%；分離膠 T=7％ C=% ? ： 凝膠緩沖液 TrisHCl,含 Cl－ ，電極緩沖液 TrisGly,Gly－ ? ： 濃縮膠 ,分離膠 ，電極緩沖液 ? （ 2）盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng) ? 樣品的濃縮效應(yīng) ? 電荷效應(yīng) ? 分子篩效應(yīng) A. 樣品的濃縮效應(yīng) 緩沖液成分及 pH的不連續(xù)性 ? 濃縮膠 ? 緩沖液 濃縮膠 TrisHCl, 電極緩沖液 TrisGly ? 解離度 ： ?Cl ?蛋 ? Gly ? mcl?clm蛋 ?蛋 m Gly ?Gly ? 凝膠中 Cl－ 為快離子， Gly－ 為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。 電位梯度的不連續(xù)性 ? E： 每厘米的電壓降 E＝ I(電流強(qiáng)度 )/?(電導(dǎo)率 ) ? E與電泳速度成正比 ? 電泳開(kāi)始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。 緩沖液 樣品 濃縮膠 分離膠 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括 ： ? 凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng) (緩沖液 ) 蛋白質(zhì)從 “ － ” 極向 “ ＋ ” 極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。 緩沖液 濃縮膠 分離膠 A. 樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括 ： ? 凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng) (緩沖液 ) 蛋白質(zhì)從 “ － ” 極向 “ ＋ ” 極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。 ? 由于各種蛋白質(zhì) pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的 有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。 在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相 。 。 在一定的條件下某種物質(zhì)的 Rf值是常數(shù) 。 、下層層析、單向?qū)游?、雙向?qū)游觥? 2． 顯色劑 %水合茚三酮丙酮溶液 。 每組配制 30ml 堿溶劑系統(tǒng)：正丁醇 :12%氨水 :95%乙醇＝ 13:3:3（ 體積比 ） ， 平衡溶劑為 12%氨水 。 ? 2． 戴手套取層析濾紙一張作標(biāo)記 。 點(diǎn)樣：干后重復(fù)點(diǎn)一次 ， 直徑最大不超過(guò) 3mm。 點(diǎn)樣面朝外 ， 點(diǎn)樣端朝下 ， 蓋上層析缸蓋 ， 平衡約 20~30分鐘 。 上沿約 1厘米時(shí) ，取出濾紙 ， 用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿界線 ， 干燥 。 脯氨酸 、 羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)外 ， 所有 α －氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì) 。 2. 點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴 。 七、思考題： ? 1．做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是什么？ ? 2．實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，為何不能用手接觸濾紙？ ? 3．影響 Rf值的因素有哪些？ 實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳 ? 實(shí)驗(yàn)原理 ? 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 ? 實(shí)驗(yàn)試劑 ? 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)原理 醋酸纖維薄膜電泳 (CAME)是以醋酸纖維薄膜 (CAM)作支持物的一種 區(qū)帶電泳技術(shù)。將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。 本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。例如人血清蛋白在 ，染色后可顯示 5條區(qū)帶。 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 （一）、材料：人血清 （二）、儀器 醋酸纖維薄膜 (8X2mm)；點(diǎn)樣器；染色皿，漂洗器， 鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳 槽；粗濾紙；直尺和鉛筆 實(shí)驗(yàn)試劑 巴比妥緩沖液 ( I=)；氨基黑 10B染色液；漂洗液；95％乙醇 45ml、冰醋酸 5ml；蒸餾水 50ml；洗脫液 ／LNaOH；透明液；無(wú)水乙醇；冰醋酸＝ 7： 3 實(shí)驗(yàn)步驟 1． 浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜放在緩沖液中浸泡 20分 鐘。 3．電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面 等高，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上 。通電，電流強(qiáng)度每條 膜 1mA(注意強(qiáng)度 ),電泳時(shí)間約為 50分鐘。 5．漂洗：將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗數(shù) 次至無(wú)蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得到色帶清晰的 電泳圖譜。 干燥后此透明薄膜 ,區(qū)帶著色清晰 ,可用于光吸收掃 描 ,長(zhǎng)期保存不褪色。 ? （ 2）學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與 Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測(cè)定。含有一個(gè)肽鍵和一個(gè) — CS— NH2， — CH2— NH2， — CRH—NH2， — CH2— NH2— CHNH2— CH2OH或 — CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)也有此反應(yīng)。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。該反應(yīng)十分靈敏， 1∶ 1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。 ? 此反應(yīng)的適宜 pH為 5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同 pH條件下的顏色深淺不同，酸度過(guò)大時(shí)甚至不顯色。 ? 多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 尿素； 10%氫氧化鈉溶液； 1%硫酸銅溶液； 2%卵清蛋白溶液； %甘氨酸溶液；%茚三酮水溶液；大豆提取液；頭發(fā)；指甲； %苯酚溶液；濃硝酸； %色氨酸溶液； %酪氨酸溶液；冰醋酸 、 濃硫酸 。用微火加熱使尿素熔化。冷后，加 10%氫氧化鈉溶液約 1ml，振蕩混勻，再加 1%硫酸銅溶液 1滴，再振蕩。要避免添加過(guò)量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。 ? ②在一小塊濾紙上滴一滴 %甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴 %茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。編號(hào)。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。 試劑 管號(hào) 水 滴 %色氨酸溶液（滴） 蛋白質(zhì)溶液（滴） 冰醋酸 （ ml） 濃硫酸 （ ml） 現(xiàn) 象 1 5 2 1 2 4 1 2 1 3 5 2 1 五、思考題： ? ？并說(shuō)明原因。 ? 在？ ? （蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）可以與濃硝酸作用呈現(xiàn)黃色反應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果？ 實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)的變性、沉淀反應(yīng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? （ 1） 加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí) 。 ? （ 3）了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。 ? （ 2）不可逆沉淀反應(yīng) 此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。 ? 蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。 三、儀器、材料和試劑 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 %雞蛋清溶液； 醋酸 醋酸鈉的緩沖溶液； 3%硝酸銀溶液； 5%三氯乙酸溶液； 95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末； molL1氫氧化鈉溶液； molL1醋酸溶液；甲基紅溶液； 2%氯化鋇溶液