【正文】 遺傳因子 ， 或者更簡單地叫做基因 ” 。 六、分子生物學(xué)的誕生 ? 1953年美國遺傳學(xué)家詹姆斯 .沃森 （ James D .Watson） 和英國生物物理學(xué)家弗朗西斯 .克里克（ Francis crick） 根據(jù)莫 .休 .弗 .威爾金斯 （ ） 的 x射線衍射等系列圖譜結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)上 ， 用標(biāo)度分子模型在英國 Max Perutz教授分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究 。 首次闡明了 DＮＡ結(jié)構(gòu)與功能 ， 為遺傳信息的貯存 、 傳遞和利用提供了科學(xué)依據(jù) ， 創(chuàng)立了現(xiàn)代分子生物學(xué) 。 Watson和 crick均為諾貝爾獎(jiǎng)獲得者 。 此螺旋為右螺旋 ， 并存在大溝和小溝 。 ? （ 3） 雙螺旋的直徑為 2nm， 兩個(gè)相鄰堿基的間距為 ， 每 10個(gè)堿基的間距為 ， 構(gòu)成一段完整的螺旋結(jié)構(gòu) ， 其相鄰堿基的夾角為 36176。 ? （ 4） 兩條多聚核苷酸鏈間堿基配對的互補(bǔ)規(guī)律為： A配對 T或 T配對 A、G配對 C或 C配對 G， 而且其分子比率為 1。 經(jīng)過自我復(fù)制出來的每一個(gè) DNA分子中的一條鏈被保留下來 。 ? （ 2） DNA是遺傳基因的載體 可以從分子水平上闡明其生物學(xué)功能： 圖 13 半保留復(fù)制示意圖 ? （ 3） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型為遺傳信息的保存 、 傳遞和利用提供了基礎(chǔ) 。 ? （ 4） DNA的調(diào)節(jié)功能 1961年 ， 法國 分 子 生 物 學(xué) 家 和 （ ）基因調(diào)節(jié)事實(shí) ， 提出了乳糖操縱子 （ Lac Operon） 假說 。 ? 第一節(jié) 概 述 ? 第二節(jié) 工具酶 ? 第三節(jié) 目的基因制備 ? 第四節(jié) 基因載體 ? 第五節(jié) 基因重組 ? 第六節(jié) 轉(zhuǎn)化、增殖和表達(dá) ? 第七節(jié) 基因工程在食品工業(yè)中應(yīng)用 ? 第八節(jié) 后基因組學(xué)及其應(yīng)用研究 第二章 食品與基因工程 第一節(jié) 概 述 一、基因工程的誕生 ? 1973年 （ PNAS） 上發(fā)表了題為“ Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro‖，闡明了體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá) ， 標(biāo)志著基因工程的誕生 二、基因工程涵義、特點(diǎn)及其操作步驟 ? 基因工程 （ gene engineering） 又稱為分子克隆 （ molecular cloning）或重組 DNA 技術(shù) （ rebinant DNA Technology） ， 其涵義為：用酶學(xué)方法 ， 將異源基因與載體 DNA在體外進(jìn)行重組 ， 將形成的重組子DNA導(dǎo)入宿體細(xì)胞 ， 使異源基因在宿體細(xì)胞中復(fù)制表達(dá) ， 從而達(dá)到改造生物品種或性狀 ， 大量生產(chǎn)出人類所需要生物品種和產(chǎn)物 。 生物材料 m R N A D N A D N A eD N A 文庫 基因組文庫 人工合成 目的基因 克隆載體 重組 DNA 受體細(xì)胞 克隆子 轉(zhuǎn)基因生物 圖 21基因工程操作過程示意圖 [2] 三、基因工程的發(fā)展 ? 1977年英國分子生物學(xué)家 DNA測序技術(shù)并首先完成的全長 5387bp的 φ 174噬菌體基因組全序列的測定 。 ? 1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物培育成功 ， 1992年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米及轉(zhuǎn)基因小麥植株誕生 ， 1994年轉(zhuǎn)基因番茄上市 。 2022年 《 人類基因組計(jì)劃 》 經(jīng)過20多年努力已宣布草圖描繪成功 。 第二節(jié) 工具酶 ? 在基因工程中應(yīng)用的酶統(tǒng)稱為工具酶 （ enzyme of tools） 。 ? II型酶分子量較小 ， 大約 20100kD， 是一種簡單的單功能酶 ， 作用時(shí)無需輔助因子或只需 Mg2+， 能識別雙鏈 DNA上特異的核苷酸序列 ，同時(shí)專一性強(qiáng) ， 而且其識別序列與切割序列相一致 。 ? 二 、 限制性內(nèi)切酶命名 ? 1973年 ， Nathaus提出限制性內(nèi)切酶的命名原則 一、限制性內(nèi)切酶 ? 限制性內(nèi)切酶 （ restriction endonuclease 簡稱 RE） 是一類專一性很強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶 ? 三 、 限制性內(nèi)切酶的作用機(jī)制和作用方式 ? 如圖 22所示 圖 22限制性核酸內(nèi)切酶作用機(jī)制 ? 其作用方式及識別位點(diǎn)有如下幾種： ? ? EcoR I識別 ? Hae I識別 ▲ 53GAAT T C???? ▲ 5 39。 ATG G C CTA??? Asu I識別 ? EcoR II識別 ? Mbo I識別 ? 注： ↑表示切割 5’磷酸二酯鍵位置 。 ▲ 5 39。 GG AC C?? ▲ 5 39。 AC C G GT?? ▲ 5 39。 GAT C??5 39。 5G G A TC C G G A TC CC C TA G G G G A TC C?? 正 讀 時(shí) 為反 讀 時(shí) 為▼ ▲ ? 限制性內(nèi)切酶錯(cuò)位切割 DNA雙鏈而形成彼此互補(bǔ)的單鏈末端 ， 稱為粘性末端 （ Cohesion ends） 。 如 Alu I的識別序列為： ? ? 四 、 限制性內(nèi)切酶識別序列及反應(yīng)系統(tǒng) ? 限制性核酸內(nèi)切酶在雙鏈 DNA上能夠識別的特殊核苷酸序列稱為識別序列 。 同尾酶 （ isocaudamer） ， 如表 23所示 。 一、生物學(xué)方法 ? 原核生物中常用鳥槍射擊法或滔彈散射法 （ shotgun cloning） 來克隆分離基因 。 ? 另一種生物學(xué)方法是采用分子雜交手段 。 二、化學(xué)合成法 化學(xué)合成一個(gè)循環(huán)有如下 4個(gè)步驟： ? 整個(gè)合成反應(yīng)歷程如圖 23表示 。 當(dāng)需要重組體 DNA某一片段時(shí) ， 便可以在此文庫中查找 。 cDNA文庫構(gòu)建的步驟： ? cDNA ? RNA和 mRNA ? cDNA第一條鏈 ? 其反應(yīng)過程為圖 25的所示 。 圖 26 置換法合成 cDNA反應(yīng)過程 四、 PCR擴(kuò)增法 ? 1985 年 ， 美國 Cetus 公 司 的Mullis等人開發(fā)成功的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ Polymerase chain reaction， PCR ） 技術(shù) ， 這一快速地?cái)U(kuò)增特異 DNA片段系統(tǒng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中是一項(xiàng)重大的革新 。 圖 27 PCR擴(kuò)增技術(shù)基本原理 第四節(jié) 基因載體 ? 目前 ， 在基因工程中應(yīng)用的基因載體主要是質(zhì)粒 、 病毒和噬菌體 ， 它們都能擔(dān)當(dāng)無性繁殖載體 。 它能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制并保持恒定遺傳的復(fù)制子 。 如圖 28所示 [5]。 pBR322大小為 4363bp， （ 1bp=1堿基對 ） 含有 2個(gè)抗生素抗性基因 。 圖 29 pBR325衍生質(zhì)粒 圖 210 pBR327衍生質(zhì)粒 （二）質(zhì)粒載體 PUC ? pUC質(zhì)粒是在 pBR322的基礎(chǔ)上 ， 在 —未端加入一段多克隆位點(diǎn)（ multiple cloning sites,MCS） 的 LacZ’基因 。 三、 M13噬菌體 四、病毒 第五節(jié) 基因重組 ? 基因重組即將目的基因 （ 或外源基因 ） 與載體在體外結(jié)合構(gòu)建形成重組子 。 PCR技術(shù)操作步驟為： ① 反復(fù)將目的基因片段進(jìn)行熱變性處理 ，令其雙股鏈解開； ② 進(jìn)行反鏈雜交 、 退火 、 形成單鏈； ③ 用 Taq DNA多聚酶沿 DNA鏈全程全成出兩股雙鏈 DNA分子； ④ 然后開始第二個(gè)反應(yīng)周期 。因此，通過 DNA重組技術(shù)使特定基因片段在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，拷貝數(shù)目大大增加，就必須使特點(diǎn)基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄、翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)（或酶），進(jìn)而獲得它們的代謝產(chǎn)物，這一過程 稱 為基因表達(dá)。 （ 一 ） 應(yīng)用于提高食品產(chǎn)品的品質(zhì) 第一個(gè)采用基因工程改造的食品微生物為面包酵母（ saccharomyces cerevisiae） 。 在啤酒釀造中 α一乙酰乳酸通過自發(fā)氧化作用形成雙乙酰 ， 雙乙酰形成機(jī)理及其基因重組控制雙乙酰如圖 21 圖 213所示 。 （三）應(yīng)用于食品的抗菌和防腐保鮮 現(xiàn)將工程菌在食品工業(yè)應(yīng)用較多的菌株如列表 24所示。 現(xiàn)將 NovoNordisk、 GistBrocades等公司采用基因工程改良霉菌種列于表 2表 2表 27。 采用基因重組構(gòu)建軍一株高表達(dá)的單鏈蛋白 ， 以加速催化生成維生素 C的前體 2KLG， 便可有效地縮短生產(chǎn)維生素 C的生產(chǎn)周期 。Stearothermophilus的 MnSOD基因克隆入大腸桿菌中 ， 其重組體MnSOD在大腸桿菌高效達(dá) ， 產(chǎn)生的 SOD占可溶性蛋白 49%。 Anammartet[14]克隆了畢氏酵母 △ 9脂肪酸脫飽和酶基因及其調(diào)節(jié)機(jī)制 。 二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品 ? 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品是由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑 。 表 28 基因重組技術(shù)改進(jìn)牛奶成分 [18] 三、轉(zhuǎn)基因植物食品 ? 所謂轉(zhuǎn)基因植物食品是指由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因植物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑 。 1994年美國 FDA批準(zhǔn)延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄上市 。 依據(jù) T區(qū)攜帶基因功能 ， 可決定植物冠癭瘤的形成和控制冠癭堿的合成 。 其基因重組和轉(zhuǎn)移過程如圖 215所示 。 在世界上有 23個(gè)作物品系已準(zhǔn)許進(jìn)行種植和飼料使用 ， 延遲成熟番茄 （ 表 210） 以及改變脂肪含量的轉(zhuǎn)基因作物 （ 如表 211） 也已在某些國家準(zhǔn)予種植 。 ? 目前 ， 我國獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因作物 （ 如表 212） 和已發(fā)放安全證書的進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品見表 213。 （ 一 ） 干酪制造工藝流程 第八節(jié) 后基因組學(xué)及其應(yīng)用研究 一、后基因組學(xué)涵義 ? 所謂后基因組學(xué) （ postgenomics） 是指包括基因組學(xué) （ genomis） 、蛋白質(zhì)組學(xué) （ proteomics） 、 代謝組學(xué) （ metabotomics） 和生物信息學(xué) （ bioinformatics） 等主要內(nèi)容 。 ? [21][22] ? “ 生物工廠 ” 提供人類優(yōu)質(zhì)食品 課程論文： ? 基因工程與食品 ? 概念清晰 ? 基因工程研究內(nèi)容和作用 ? 基因工程在食品中應(yīng)用的優(yōu)勢方面。 ? 理性設(shè)計(jì)是在蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾改造 ， 但是 ， 產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)確定 、 具有新功能特性蛋白質(zhì)并不容易 ， 無法滿足對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行分子改良的要求 。 非理性設(shè)計(jì)的主要技術(shù)包括定向進(jìn)化 (directed evolution) 、 DNA 改組 (gene shuffling)及融合蛋白 (fusions of proteins)技術(shù)等 。 通過酶結(jié)構(gòu)或局部構(gòu)象的調(diào)整和改造 ， 可大大提高食品專用酶制劑的耐高溫 、 抗氧化能力 ， 增加酶的穩(wěn)定性和適用 pH 范圍 ， 從而獲得性質(zhì)更穩(wěn)定 、 作用效率更高的酶 。 ? 表 31列出了蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 蛋白質(zhì)幾何優(yōu)化 結(jié)構(gòu)比對分析 天然蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)晶體學(xué) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 突變體設(shè)計(jì)預(yù)測 合成定位突變 從數(shù)據(jù)庫輸入 分離純化與表征 新蛋白質(zhì) 圖 31 蛋白質(zhì)理性分子設(shè)計(jì)流程圖 表 31 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 ? 表 32列出了目前蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)所涉及的計(jì)算工具及軟件 。 表 33 部分應(yīng)用定位突變技術(shù)取得成效的工業(yè)酶制劑 ? （ 一 ） 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變的原理是用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物 ，在聚合酶的作用下啟動(dòng) DNA 分子進(jìn)行復(fù)制 。 ? PCR 介導(dǎo)的定位突變法優(yōu)點(diǎn)是操作較簡單 ， 突變的成功率可達(dá)100%。 圖 33 PCR介導(dǎo)的定位突變方法 三、定位突變技術(shù)在酶結(jié)構(gòu)改造中的應(yīng)用 ? （ 一 ） 淀粉酶 ， 通過定位突變技術(shù)得到了一種 α淀粉酶的雙突變體A209V/H133T， 該突變酶在 90℃ 時(shí)的半衰期比正常酶增加了 9 倍 。 ? （ 三 ） 脂肪酶 ， Yamaguchi 等采用定位突變將 Cys 二硫鍵引入 Humicola lanuginsa 脂肪酶 ， 使突變體的熱穩(wěn)定性提高了 12℃ ， 酶的最適溫度提高了10℃ 。 利用定位突變的方法將 Trichoderma reesei堿性纖維素酶的 Glu13 Asn179和 Asp194 突變?yōu)?Lys， 其熱穩(wěn)定性得到了提高 。 DNA體外進(jìn)化的模式見圖 34。 見圖 35。 三、容錯(cuò) PCR ? 容錯(cuò) PCR 是指在利用 Taq聚合酶進(jìn)行目的基因的 PCR 擴(kuò)增的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配 ， 導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變的一種 DNA體外進(jìn)化技術(shù) 。表 34列出了通過定向進(jìn)化技術(shù)研究獲得成功的一些酶制劑