【正文】 較少的 ? 目前，“吸煙有害健康”的“證據(jù)”主要來自于流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗研究的結(jié)果，存在商榷之處 吸煙者的“誤區(qū)” ? 停止吸煙會導(dǎo)致體重增加 ? 沒有直接證據(jù)表明吸煙能導(dǎo)致癌癥 ? 肺癌是多因素疾病 ? 絕大多數(shù)人都吸煙 ? 吸煙的危害遠(yuǎn)沒有政府宣傳和倡導(dǎo)的那么嚴(yán)重 ? 許多重度吸煙者并沒有得病，且壽命很長 ? 目前市場是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應(yīng)該說是安全的 ? 環(huán)境煙草煙氣對不吸煙者并沒有嚴(yán)重的影響 問題 中式卷煙的 生物醫(yī)學(xué)評價技術(shù) —— 技術(shù)原理與方法 篩選對煙氣敏感的細(xì)胞系： 用于實驗研究的細(xì)胞系有數(shù)百種，其中人支氣管上皮細(xì)胞 (BEAS2B)富含 P450酶，在無需代謝活化因子 S9時能轉(zhuǎn)化利用NNK等煙氣中主要有害物質(zhì) 研制中的細(xì)胞氣體中毒裝置 ：細(xì)胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類吸煙實際情況有差別，研制細(xì)胞氣體中毒裝臵對煙氣評價意義重大 卷煙煙氣毒理學(xué)評價 動物吸煙中毒實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ?動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸入卷煙煙氣 動物吸煙試驗 煙氣細(xì)胞中毒試驗 急性毒性 評價方案 急性毒性 慢性毒性 蓄積毒性 生殖毒性 免疫毒性 增殖死亡 氧化損傷 膜損傷 致突致畸致癌 基因毒性 煙草煙氣中有數(shù)千種物質(zhì)，單一或數(shù)種有害成分的分析難以全面真實客觀地反映吸煙的健康影響。通過與同品質(zhì)對照煙比較，檢驗降焦減害技術(shù)應(yīng)用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。 最好是 2種染毒途徑 。動物到達(dá)后，按 SOPA034的要求接收。 1℃ ，濕度 60177。由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。由實驗動物中心提供標(biāo)準(zhǔn)飼料。用飲水瓶供應(yīng)消毒自來水，由動物自由飲用。將有機(jī)溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調(diào)整為 1支煙 /ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，造成細(xì)胞煙氣中毒的實驗?zāi)Ｐ? 細(xì)胞系及其暴露卷煙煙氣染毒 ? 通常急性毒性是指動物 1d內(nèi)單次或多次染毒后在 7~14d中連續(xù)觀察動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況 。細(xì)胞活性氧水平反應(yīng)了細(xì)胞對外源性有害因素作用時的毒性應(yīng)答，也就是外源性化合物的毒性 ? 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 細(xì)胞 中，分子探針 DCFHDA和 HE可分別與 H2O2和 O2.—反應(yīng)，生成二氯熒光黃 （ DCF）和溴乙錠 （ EB），并產(chǎn)生 綠色 和 紅色 熒光，通過測定細(xì)胞內(nèi) DCF和 /或 EB的熒光強(qiáng)度，即可相對定量細(xì)胞內(nèi)H2O2和 O2.—水平 ? 細(xì)胞外活性含量 過氧化氫（ H2O2） 用 辣根過氧化物酶和 酚紅 捕獲，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量； 超氧陰離子（ O2.—） 用 細(xì)胞色素 C捕獲，通過測定吸光度改變進(jìn)行定量； 羥自由基（ .OH） 用 番紅花紅 捕獲，通過測定吸光度改變進(jìn)行定量 過氧化氫 ? 細(xì)胞膜 是細(xì)胞與外界的屏蔽，具有 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 與 物質(zhì)交換的重要功能。細(xì)胞膜損傷可從以下幾個方面進(jìn)行評價： ? 膜的通透性 乳酸脫氫酶 （ LDH） 是胞漿中的一種常見酶，通常情況下不能透過細(xì)胞膜外逸，因此，通過檢測細(xì)胞外 LDH的活性，可以評價 膜通透性 的改變 ? 膜的結(jié)構(gòu)與功能 腺苷三磷酸酶 （ ATPase） 是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動跨膜運輸。 Kex 362nm , Kem 432nm ,狹縫 10nm ,測溫 25 ℃ 細(xì)胞膜損傷 ? 長期毒性 （ 也稱為亞急性毒性 、 亞慢性毒性 、 慢性毒性或終生毒性 ） 是指動物反復(fù)多次染毒的毒性反應(yīng) 。 分別在吸煙前 、 吸煙期間的 1個月和 2個月 、 停止吸煙時 （ 吸煙后 3個月 ） 、 停止吸煙后 1個月 （ 吸煙后 4個月 ） 觀察動物體重變化 、 血液學(xué)參數(shù) 。 觀察指標(biāo)包括 ? 一般觀察 外觀體征和行為活動 （ 如神態(tài)萎靡 、 倦縮不動或過度興奮 、 躁動驚跳 、 肌肉麻痹或震顫 、 步態(tài)異常等 ） ， 皮毛帖身或稀疏豎散 ， 糞便性狀 、 顏色 ， 食量及體重變化等 ? 血液學(xué)指標(biāo) 紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù) ， 血紅蛋白含量 ， 白細(xì)胞及其分類細(xì)胞數(shù) ， 血小板計數(shù) ， 凝血時間等 ? 血液生化指標(biāo) 天氡氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （ AST） 、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （ALT） 、 堿性磷酸酶 （ ALP） 、 尿素氮 （ BUN） 、 總蛋白 （ TP） 、 白蛋白 （ ALB） 、 血糖 （ GLU） 、 總膽紅素 （ TBIL） 、 肝酐 （ CREA） 、 總膽固醇 （ TCH） 、 鈣濃度 （ CA） 等 ? 病檢器官 心 、 肝 、 脾 、 肺 、 腎 、 腎上腺 、 甲狀腺 、 胸腺 、 睪丸 (子宮 )、腦 、 交列腺等的重量及其系數(shù) ， 以及部分器官的病理學(xué)檢查 動物暴露卷煙煙氣的慢性毒性試驗 ? 細(xì)菌回復(fù)突變試驗 即 Ames試驗。利用正常細(xì)胞中HPRT酶活性，加入毒性嘌呤類似物 6巰基鳥嘌呤 （ 6TG）培養(yǎng)，細(xì)胞死亡，而 HPRT基因突變的細(xì)胞對 6TG有抗性而活存，并形成克隆，以此可以檢測 HPRT基因突變 ? 人類 11號染色體基因突變分析 用人 中國倉鼠卵巢雜交細(xì)胞 （ AL細(xì)胞）檢測 人類 11號染色體 （ Hchr 11）基因突變是近幾年發(fā)展起來的一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測基因突變的實驗方法 基因突變 ? 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)化是是細(xì)胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細(xì)胞癌前病變的重要標(biāo)志，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖速度加快（倍增時間縮短），細(xì)胞間接觸抑制消失（疊層生長），并具有異種組織的浸潤性（轉(zhuǎn)移）。年齡以剛斷乳為宜，因它們的易感性較高，同時也可具有較長的實驗觀察時間。確定誘癌潛伏期的長短以第一例癌瘤發(fā)現(xiàn)時間或平均癌瘤發(fā)現(xiàn)時間計。提示： ? 五葉神煙的細(xì)胞毒性明顯降低 ? 不同細(xì)胞系對卷煙煙氣敏感性不同 ? BEAS2B細(xì)胞對空白煙的敏感性約是 SHE細(xì)胞的 ；而對五葉神煙的敏感性僅為 SHE細(xì)胞的 ：提示： ? 五葉神卷煙煙氣中能被 P450酶活化的有害物質(zhì)降低？ 過氧化氫（ H2O2） 超氧陰離子 （ ） y = 1 6 1 6 9 1 x + 3 8 3 . 3 5y = 9 7 9 4 5 x + 3 2 1 . 9 7010002022300040000 煙濃度 ( 支 / ml )細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子水平/RFU五葉神對照煙y = 6 9 7 3 3 x + 3 6 9 . 2y = 4 5 2 0 9 x + 3 2 3 . 6 504008001200160020220 0 . 0 0 5 0 . 0 1 0 . 0 1 5 0 . 0 2 0 . 0 2 5煙濃度 ( 支 / m l )細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平/RFU五葉神對照煙五葉神及其對照煙誘發(fā) 細(xì)胞內(nèi) ROS增高 ? 五葉神卷煙誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)過氧經(jīng)氫和超氧陰離子增高的能力分別僅為對照煙的 65%和 60%。 ? 不同種類活性氧對煙氣的敏感性不同： 超氧陰離子的增高為過氧化氫的 y = 6 3 7 . 3 4 x + 1 0 . 5y = 2 5 6 . 3 9 x + 1 0 . 551015200 0 . 0 0 4 0 . 0 0 8 0 . 0 1 2吸煙量 ( 支 / m l )過氧化氫(mM)五葉神空白煙五葉神煙誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生的 過氧化氫 和 超氧陰離子 含量含量增高分別僅為同品質(zhì)對照煙的 40%和 29%， 羥自由基 含量不僅明顯低于同品質(zhì)對照煙，而且觀察到對 羥自由基 的清除 (?)作用。 五葉神及其對照煙誘發(fā) 細(xì)胞外 ROS含量增高 y = 8 1 4 . 1 9 x + 5y = 2 3 4 . 8 7 x + 50510150 0 . 0 0 4 0 . 0 0 8 0 . 0 1 2吸煙量 ( 支 / m l )超氧陰離子(mM)五葉神空白煙y = 6 3 7 x2 3 . 6 3 0 2 x + 0 . 8y = 1 2 7 7 . 2 x2 3 8 . 8 1 9 x + 0 . 7 801230 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6煙濃度 ( 支 / m l )羥自由基含量(nM)五葉神空白煙y = 16509x + 120y = 46491x + 12002004006008000 0 . 0 0 4 0 . 0 0 8 0 . 0 1 2劑量（支/ m l ）乳酸脫氫酶活性(U)五葉神空白煙五葉神及其對照煙對 膜通透性 影響 ? 乳酸脫氫酶 （ LDH） 是胞漿中一種常見酶，通常情況下不能透過細(xì)胞膜外逸，因此通過檢測