【正文】 巴金森氏癥 900 300 1,200 子宮肌瘤 100 100合計 900 400 1,300 總數(shù) 80,400 41,300 121,800 問題 ? 如果不進(jìn)行劑量分析和評價，單憑卷煙煙氣中存在的有害成分，就認(rèn)定其對健康有不良影響，是不科學(xué)的 “ 所有的物質(zhì)本身并非毒物，劑量才使一種物質(zhì)變成毒物 ” “ 毒物和藥物之間的區(qū)別在于正確的劑量 ” —— 16世紀(jì)著名醫(yī)學(xué)家 Paracelsus ? 與城市空氣污染比較，人類接觸有害環(huán)境因素中，來自于卷煙煙氣，相對來說是較少的 ? 目前，“吸煙有害健康”的“證據(jù)”主要來自于流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗研究的結(jié)果，存在商榷之處 吸煙者的“誤區(qū)” ? 停止吸煙會導(dǎo)致體重增加 ? 沒有直接證據(jù)表明吸煙能導(dǎo)致癌癥 ? 肺癌是多因素疾病 ? 絕大多數(shù)人都吸煙 ? 吸煙的危害遠(yuǎn)沒有政府宣傳和倡導(dǎo)的那么嚴(yán)重 ? 許多重度吸煙者并沒有得病，且壽命很長 ? 目前市場是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應(yīng)該說是安全的 ? 環(huán)境煙草煙氣對不吸煙者并沒有嚴(yán)重的影響 問題 中式卷煙的 生物醫(yī)學(xué)評價技術(shù) —— 技術(shù)原理與方法 篩選對煙氣敏感的細(xì)胞系： 用于實驗研究的細(xì)胞系有數(shù)百種，其中人支氣管上皮細(xì)胞 (BEAS2B)富含 P450酶，在無需代謝活化因子 S9時能轉(zhuǎn)化利用NNK等煙氣中主要有害物質(zhì) 研制中的細(xì)胞氣體中毒裝置 ：細(xì)胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類吸煙實際情況有差別，研制細(xì)胞氣體中毒裝臵對煙氣評價意義重大 卷煙煙氣毒理學(xué)評價 動物吸煙中毒實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ?動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸入卷煙煙氣 動物吸煙試驗 煙氣細(xì)胞中毒試驗 急性毒性 評價方案 急性毒性 慢性毒性 蓄積毒性 生殖毒性 免疫毒性 增殖死亡 氧化損傷 膜損傷 致突致畸致癌 基因毒性 煙草煙氣中有數(shù)千種物質(zhì)，單一或數(shù)種有害成分的分析難以全面真實客觀地反映吸煙的健康影響。卷煙煙氣毒理學(xué)評價是以吸煙產(chǎn)生的煙氣做為整體，通過動物和細(xì)胞中毒試驗，用毒理學(xué)的方法，對卷煙煙氣的健康影響進(jìn)行評價。通過與同品質(zhì)對照煙比較，檢驗降焦減害技術(shù)應(yīng)用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。 其他功能檢測 第一級 ， 動物要求 2種 ， 雌雄各半 ， 細(xì)胞至少 2種 ， 代表人和動物來源的支氣管和成纖維細(xì)胞各 1種 。 最好是 2種染毒途徑 。 如果兩種卷煙 （ 一般是試驗樣品煙和對照煙 ） 的急性毒性差異明顯 ， 則無需進(jìn)行進(jìn)一步的評價 ， 否則需進(jìn)行第二級和第三級 ， 甚至其他評價實驗 分級評價方案 動物實驗 細(xì)胞實驗 一級 急性毒性試驗 細(xì)胞存活試驗 二級 亞慢毒試驗 細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞膜損傷試驗 三級 三致（致突、致畸和致癌）試驗 基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 其他實驗 免疫和抗氧化功能損傷，呼吸道損傷，心血管系統(tǒng)檢查等 基因與蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測 實驗動物及其吸煙染毒 ? 實驗動物 昆明小鼠和 Wistar大鼠是我國 “ 新藥審批辦法 ” 推薦使用的動物。動物到達(dá)后，按 SOPA034的要求接收。每籠 5只，飼養(yǎng)在二級動物房內(nèi)，溫度 30177。 1℃ ，濕度 60177。 5%。由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。所有動物按 SOPA035要求檢疫觀察 13天，在此時間內(nèi)觀察動物的疾病和死亡指征，出現(xiàn)異?，F(xiàn)象需向?qū)ｎ}負(fù)責(zé)人和臨床獸醫(yī)報告。由實驗動物中心提供標(biāo)準(zhǔn)飼料。從動物到達(dá)至研究結(jié)束自由攝食。用飲水瓶供應(yīng)消毒自來水，由動物自由飲用。每日沖洗飲水瓶 ? 吸煙染毒 用吸煙器吸煙，將煙氣導(dǎo)入中毒室（有機玻璃盒），動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻的條件下自由吸入卷煙煙氣，造成動物吸煙中毒的實驗?zāi)Ｐ? ? 用于實驗研究的靶細(xì)胞主要有 鼠 或 人 來源的 成纖維細(xì)胞和 上皮細(xì)胞 四大類 ? 敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞 （ SHE） ? 優(yōu)點： 易獲得，易培養(yǎng)，穩(wěn)定，經(jīng)濟 ? 缺點： 敏感性較差，結(jié)果難以外推到人 ? 人支氣管上皮細(xì)胞 （ BEAS2B） ? 優(yōu)點 ：敏感性好，與人類接近 ? 缺點： 難培養(yǎng)，費用高 ? 將吸煙器抽煙的煙氣，分別經(jīng)過有機相（乙酸乙酯）和無機相（基本培養(yǎng)液）收集。將有機溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調(diào)整為 1支煙 /ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，造成細(xì)胞煙氣中毒的實驗?zāi)Ｐ? 細(xì)胞系及其暴露卷煙煙氣染毒 ? 通常急性毒性是指動物 1d內(nèi)單次或多次染毒后在 7~14d中連續(xù)觀察動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況 。 考慮到吸煙的實際情況 ， 在吸煙的急性毒性實驗中 ， 我們采用所有動物同時開始吸煙 ， 連續(xù)染毒 ， 直至全部動物死亡為止 ， 觀察動物吸煙的反應(yīng) ， 準(zhǔn)確記錄每只動物的死亡時間和吸煙量 ， 計算平均活存時間和平均致死吸煙量 ， 提供以下實驗結(jié)果： ? 第一只動物和最后一只動物死亡的時間和致死吸煙量 （即死亡時間和劑量的范圍 ） ? 一半動物發(fā)生死亡的時間和吸煙量 （ T1/2和 LD50） ? 對照煙動物全部死亡時 ， 實驗煙動物的活存率 ? 必要時，需對急性致死動物的進(jìn)行病理觀察 動物暴露卷煙煙氣的急性毒性試驗 細(xì)胞存活試驗 ? 細(xì)胞在正常情況下按一定生長速度倍增，當(dāng)受到有害因素作用時，細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，表現(xiàn)出直接死亡或增殖性死亡 ? 接種效率試驗 細(xì)胞在低密度接種條件下，受損傷細(xì)胞不能存活，而正常細(xì)胞在一定時間后形成集落（克?。?，通過計數(shù)克隆數(shù)，可以計算活存細(xì)胞百分?jǐn)?shù) ? MTT試驗 噻唑蘭（ MTT）是一種細(xì)胞染料，能被活細(xì)胞在生長過程中利用并在細(xì)胞內(nèi)沉積，因此， MTT試驗可用來檢測細(xì)胞增殖死亡率，評價有害物質(zhì)對細(xì)胞的毒性作用 細(xì)胞氧化損傷 —— 活性氧檢測 ? 幾乎所有的環(huán)境有害因素均能通過直接或間接作用，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生包括活性氧在內(nèi)的自由基，這一方面是由于外源性化合物的代謝活化，并與其細(xì)胞或基因毒性密切相關(guān)；另一方面是細(xì)胞應(yīng)激性啟動抗氧化防御機制以對抗外源性有害因素可能導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。細(xì)胞活性氧水平反應(yīng)了細(xì)胞對外源性有害因素作用時的毒性應(yīng)答，也就是外源性化合物的毒性 ? 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 細(xì)胞 中，分子探針 DCFHDA和 HE可分別與 H2O2和 O2.—反應(yīng)，生成二氯熒光黃 （ DCF）和溴乙錠 （ EB），并產(chǎn)生 綠色 和 紅色 熒光，通過測定細(xì)胞內(nèi) DCF和 /或 EB的熒光強度，即可相對定量細(xì)胞內(nèi)H2O2和 O2.—水平 ? 細(xì)胞外活性含量 過氧化氫（ H2O2） 用 辣根過氧化物酶和 酚紅 捕獲，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量； 超氧陰離子（ O2.—） 用 細(xì)胞色素 C捕獲，通過測定吸光度改變進(jìn)行定量； 羥自由基（ .OH） 用 番紅花紅 捕獲，通過測定吸光度改變進(jìn)行定量 過氧化氫 ? 細(xì)胞膜 是細(xì)胞與外界的屏蔽，具有 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 與 物質(zhì)交換的重要功能。有人提出膜損傷是疾病發(fā)生甚至癌變的標(biāo)志。細(xì)胞膜損傷可從以下幾個方面進(jìn)行評價： ? 膜的通透性 乳酸脫氫酶 （ LDH） 是胞漿中的一種常見酶，通常情況下不能透過細(xì)胞膜外逸，因此，通過檢測細(xì)胞外 LDH的活性，可以評價 膜通透性 的改變 ? 膜的結(jié)構(gòu)與功能 腺苷三磷酸酶 （ ATPase） 是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動跨膜運輸。通過檢測細(xì)胞膜 ATPase的活性，可以評價 膜功能性 的改變 ? 膜的流動性 采用熒光偏振法，細(xì)胞經(jīng) DPH熒光探針標(biāo)記后，用熒光分光光度計測熒光偏振度。 Kex 362nm , Kem 432nm ,狹縫 10nm ,測溫 25 ℃ 細(xì)胞膜損傷 ? 長期毒性 （ 也稱為亞急性毒性 、 亞慢性毒性 、 慢性毒性或終生毒性 ） 是指動物反復(fù)多次染毒的毒性反應(yīng) 。 實驗時 ， 動物每天固定時間吸煙 1次 ， 按實驗設(shè)計要求控制吸煙時間和吸煙量 ， 持續(xù) 3個月后活殺一批 ， 余下動物繼續(xù)飼養(yǎng) 1個月進(jìn)行恢復(fù)期觀察 。 分別在吸煙前 、 吸煙期間的 1個月和 2個月 、 停止吸煙時 （ 吸煙后 3個月 ） 、 停止吸煙后 1個月 （ 吸煙后 4個月 ） 觀察動物體重變化 、 血液學(xué)參數(shù) 。 實驗結(jié)束后 ， 全部處死動物 ， 進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察 。 觀察指標(biāo)包括 ? 一般觀察 外觀體征和行為活動 （ 如神態(tài)萎靡 、 倦縮不動或過度興奮 、 躁動驚跳 、 肌肉麻痹或震顫 、 步態(tài)異常等 ） ， 皮毛帖身或稀疏豎散 ， 糞便性狀 、 顏色 ， 食量及體重變化等 ? 血液學(xué)指標(biāo) 紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù) ， 血紅蛋白含量 ， 白細(xì)胞及其分類細(xì)胞數(shù) ， 血小板計數(shù) ， 凝血時間等 ? 血液生化指標(biāo) 天氡氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （ AST） 、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （ALT） 、 堿性磷酸酶 （ ALP） 、 尿素氮 （