【正文】 巴金森氏癥 900 300 1,200 子宮肌瘤 100 100合計 900 400 1,300 總數(shù) 80,400 41,300 121,800 問題 ? 如果不進行劑量分析和評價，單憑卷煙煙氣中存在的有害成分，就認定其對健康有不良影響，是不科學的 “ 所有的物質本身并非毒物，劑量才使一種物質變成毒物 ” “ 毒物和藥物之間的區(qū)別在于正確的劑量 ” —— 16世紀著名醫(yī)學家 Paracelsus ? 與城市空氣污染比較，人類接觸有害環(huán)境因素中，來自于卷煙煙氣，相對來說是較少的 ? 目前，“吸煙有害健康”的“證據(jù)”主要來自于流行病學調(diào)查和動物實驗研究的結果，存在商榷之處 吸煙者的“誤區(qū)” ? 停止吸煙會導致體重增加 ? 沒有直接證據(jù)表明吸煙能導致癌癥 ? 肺癌是多因素疾病 ? 絕大多數(shù)人都吸煙 ? 吸煙的危害遠沒有政府宣傳和倡導的那么嚴重 ? 許多重度吸煙者并沒有得病，且壽命很長 ? 目前市場是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應該說是安全的 ? 環(huán)境煙草煙氣對不吸煙者并沒有嚴重的影響 問題 中式卷煙的 生物醫(yī)學評價技術 —— 技術原理與方法 篩選對煙氣敏感的細胞系： 用于實驗研究的細胞系有數(shù)百種，其中人支氣管上皮細胞 (BEAS2B)富含 P450酶，在無需代謝活化因子 S9時能轉化利用NNK等煙氣中主要有害物質 研制中的細胞氣體中毒裝置 ：細胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類吸煙實際情況有差別，研制細胞氣體中毒裝臵對煙氣評價意義重大 卷煙煙氣毒理學評價 動物吸煙中毒實驗模型建立： 動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸入卷煙煙氣 動物吸煙試驗 煙氣細胞中毒試驗 急性毒性 評價方案 急性毒性 慢性毒性 蓄積毒性 生殖毒性 免疫毒性 增殖死亡 氧化損傷 膜損傷 致突致畸致癌 基因毒性 煙草煙氣中有數(shù)千種物質，單一或數(shù)種有害成分的分析難以全面真實客觀地反映吸煙的健康影響。卷煙煙氣毒理學評價是以吸煙產(chǎn)生的煙氣做為整體，通過動物和細胞中毒試驗，用毒理學的方法，對卷煙煙氣的健康影響進行評價。通過與同品質對照煙比較，檢驗降焦減害技術應用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。 其他功能檢測 第一級 ， 動物要求 2種 ， 雌雄各半 ， 細胞至少 2種 ， 代表人和動物來源的支氣管和成纖維細胞各 1種 。 最好是 2種染毒途徑 。 如果兩種卷煙 （ 一般是試驗樣品煙和對照煙 ） 的急性毒性差異明顯 ， 則無需進行進一步的評價 ， 否則需進行第二級和第三級 ， 甚至其他評價實驗 分級評價方案 動物實驗 細胞實驗 一級 急性毒性試驗 細胞存活試驗 二級 亞慢毒試驗 細胞氧化應激和細胞膜損傷試驗 三級 三致（致突、致畸和致癌）試驗 基因突變和細胞轉化試驗 其他實驗 免疫和抗氧化功能損傷，呼吸道損傷，心血管系統(tǒng)檢查等 基因與蛋白質表達水平檢測 實驗動物及其吸煙染毒 ? 實驗動物 昆明小鼠和 Wistar大鼠是我國 “ 新藥審批辦法 ” 推薦使用的動物。動物到達后，按 SOPA034的要求接收。每籠 5只，飼養(yǎng)在二級動物房內(nèi)，溫度 30177。 1℃ ，濕度 60177。 5%。由獲得資格認可的人員飼養(yǎng)。所有動物按 SOPA035要求檢疫觀察 13天，在此時間內(nèi)觀察動物的疾病和死亡指征，出現(xiàn)異常現(xiàn)象需向專題負責人和臨床獸醫(yī)報告。由實驗動物中心提供標準飼料。從動物到達至研究結束自由攝食。用飲水瓶供應消毒自來水，由動物自由飲用。每日沖洗飲水瓶 ? 吸煙染毒 用吸煙器吸煙，將煙氣導入中毒室（有機玻璃盒），動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻的條件下自由吸入卷煙煙氣，造成動物吸煙中毒的實驗模型 ? 用于實驗研究的靶細胞主要有 鼠 或 人 來源的 成纖維細胞和 上皮細胞 四大類 ? 敘利亞地鼠胚胎細胞 （ SHE） ? 優(yōu)點： 易獲得，易培養(yǎng)，穩(wěn)定，經(jīng)濟 ? 缺點： 敏感性較差，結果難以外推到人 ? 人支氣管上皮細胞 （ BEAS2B） ? 優(yōu)點 ：敏感性好，與人類接近 ? 缺點： 難培養(yǎng)，費用高 ? 將吸煙器抽煙的煙氣，分別經(jīng)過有機相（乙酸乙酯）和無機相（基本培養(yǎng)液）收集。將有機溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調(diào)整為 1支煙 /ml，加入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，造成細胞煙氣中毒的實驗模型 細胞系及其暴露卷煙煙氣染毒 ? 通常急性毒性是指動物 1d內(nèi)單次或多次染毒后在 7~14d中連續(xù)觀察動物產(chǎn)生的毒性反應及死亡情況 。 考慮到吸煙的實際情況 ， 在吸煙的急性毒性實驗中 ， 我們采用所有動物同時開始吸煙 ， 連續(xù)染毒 ， 直至全部動物死亡為止 ， 觀察動物吸煙的反應 ， 準確記錄每只動物的死亡時間和吸煙量 ， 計算平均活存時間和平均致死吸煙量 ， 提供以下實驗結果： ? 第一只動物和最后一只動物死亡的時間和致死吸煙量 （即死亡時間和劑量的范圍 ） ? 一半動物發(fā)生死亡的時間和吸煙量 （ T1/2和 LD50） ? 對照煙動物全部死亡時 ， 實驗煙動物的活存率 ? 必要時，需對急性致死動物的進行病理觀察 動物暴露卷煙煙氣的急性毒性試驗 細胞存活試驗 ? 細胞在正常情況下按一定生長速度倍增，當受到有害因素作用時，細胞周期發(fā)生紊亂，表現(xiàn)出直接死亡或增殖性死亡 ? 接種效率試驗 細胞在低密度接種條件下，受損傷細胞不能存活，而正常細胞在一定時間后形成集落（克?。ㄟ^計數(shù)克隆數(shù)，可以計算活存細胞百分數(shù) ? MTT試驗 噻唑蘭（ MTT）是一種細胞染料，能被活細胞在生長過程中利用并在細胞內(nèi)沉積，因此， MTT試驗可用來檢測細胞增殖死亡率，評價有害物質對細胞的毒性作用 細胞氧化損傷 —— 活性氧檢測 ? 幾乎所有的環(huán)境有害因素均能通過直接或間接作用，誘發(fā)細胞產(chǎn)生包括活性氧在內(nèi)的自由基，這一方面是由于外源性化合物的代謝活化，并與其細胞或基因毒性密切相關；另一方面是細胞應激性啟動抗氧化防御機制以對抗外源性有害因素可能導致的細胞損傷。細胞活性氧水平反應了細胞對外源性有害因素作用時的毒性應答，也就是外源性化合物的毒性 ? 細胞內(nèi)活性氧水平 細胞 中，分子探針 DCFHDA和 HE可分別與 H2O2和 O2.—反應，生成二氯熒光黃 （ DCF）和溴乙錠 （ EB），并產(chǎn)生 綠色 和 紅色 熒光，通過測定細胞內(nèi) DCF和 /或 EB的熒光強度，即可相對定量細胞內(nèi)H2O2和 O2.—水平 ? 細胞外活性含量 過氧化氫（ H2O2） 用 辣根過氧化物酶和 酚紅 捕獲，通過標準曲線進行定量； 超氧陰離子（ O2.—） 用 細胞色素 C捕獲，通過測定吸光度改變進行定量； 羥自由基（ .OH） 用 番紅花紅 捕獲，通過測定吸光度改變進行定量 過氧化氫 ? 細胞膜 是細胞與外界的屏蔽，具有 信號轉導 與 物質交換的重要功能。有人提出膜損傷是疾病發(fā)生甚至癌變的標志。細胞膜損傷可從以下幾個方面進行評價： ? 膜的通透性 乳酸脫氫酶 （ LDH） 是胞漿中的一種常見酶，通常情況下不能透過細胞膜外逸，因此，通過檢測細胞外 LDH的活性，可以評價 膜通透性 的改變 ? 膜的結構與功能 腺苷三磷酸酶 （ ATPase） 是細胞膜上的一種重要酶，負責重要離子的主動跨膜運輸。通過檢測細胞膜 ATPase的活性，可以評價 膜功能性 的改變 ? 膜的流動性 采用熒光偏振法，細胞經(jīng) DPH熒光探針標記后，用熒光分光光度計測熒光偏振度。 Kex 362nm , Kem 432nm ,狹縫 10nm ,測溫 25 ℃ 細胞膜損傷 ? 長期毒性 （ 也稱為亞急性毒性 、 亞慢性毒性 、 慢性毒性或終生毒性 ） 是指動物反復多次染毒的毒性反應 。 實驗時 ， 動物每天固定時間吸煙 1次 ， 按實驗設計要求控制吸煙時間和吸煙量 ， 持續(xù) 3個月后活殺一批 ， 余下動物繼續(xù)飼養(yǎng) 1個月進行恢復期觀察 。 分別在吸煙前 、 吸煙期間的 1個月和 2個月 、 停止吸煙時 （ 吸煙后 3個月 ） 、 停止吸煙后 1個月 （ 吸煙后 4個月 ） 觀察動物體重變化 、 血液學參數(shù) 。 實驗結束后 ， 全部處死動物 ， 進行肺組織病理學觀察 。 觀察指標包括 ? 一般觀察 外觀體征和行為活動 （ 如神態(tài)萎靡 、 倦縮不動或過度興奮 、 躁動驚跳 、 肌肉麻痹或震顫 、 步態(tài)異常等 ） ， 皮毛帖身或稀疏豎散 ， 糞便性狀 、 顏色 ， 食量及體重變化等 ? 血液學指標 紅細胞或網(wǎng)織紅細胞細胞數(shù) ， 血紅蛋白含量 ， 白細胞及其分類細胞數(shù) ， 血小板計數(shù) ， 凝血時間等 ? 血液生化指標 天氡氨酸氨基轉換酶 （ AST） 、 丙氨酸氨基轉換酶 （ALT） 、 堿性磷酸酶 （ ALP） 、 尿素氮 （