【正文】 擴(kuò)大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。 (1)培養(yǎng)基組成 培養(yǎng)基組成（ %） T613 B9 T738 水解糖 玉米漿 磷酸氫二鉀 硫酸鎂 尿素 Fe++（ ppm） Mn++（ ppm） pH 2 2 2 2 2 2 2 2 (2)培養(yǎng)條件 接種量： ~％ 培養(yǎng)溫度： 32~34℃ 培養(yǎng)時間： 7~8h 通風(fēng)量： 50L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 340r／ min； 250L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 300r／ min 500L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 230r／ min (3)二級種子的質(zhì)量要求 種齡： 7~8h pH： 左右 OD 值凈增 左右 無菌檢查 () 噬菌體檢查 () 二、啤酒酵母的 擴(kuò)大培養(yǎng) 一般可采用三級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第 1 級到第 2 級為 810 倍，第 2 級到第 3 級為 46 倍。 （ 1）從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 通常有兩種方式 2，從種子罐接種 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 一、菌種的保藏 菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平 缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于 ―體眠 ‖狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 菌種保藏的方法 （ 1）斜面低溫保藏法 將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于 4 冰箱保藏，每隔一定時間進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。其缺點(diǎn)是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達(dá) l年以上。 （ 3）砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。適用于細(xì)菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對干燥敏感的無芽孢的細(xì)菌和酵母菌。 （ 4）冷凍干燥法 此法的原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。 微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，并需有一定設(shè)備條件。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于 10%甘油或二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于 70℃下保藏。 二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活動能力，其世代時間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。對誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。如培養(yǎng)基中微量元素缺乏會導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會消失。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決辦法。 引起菌種退化的原因主要有： 基因突變 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。當(dāng)然，這些負(fù)突變都是自發(fā)形成的。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺 陷型發(fā)生回復(fù)突變就會使產(chǎn)量水平下降。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。 變異菌株性狀分離 變異菌株性狀分離也會引起高產(chǎn)型狀的喪失。這是一種廣義的退化現(xiàn)象。即使菌落是由一個孢子或單個細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時，如果雙鏈 DNA 上僅一條鏈上某個位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會出現(xiàn)性狀分離。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞 DNA 雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變 ，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。 不同劑量紫外線處理裂殖酵母時不純菌落百分?jǐn)?shù) 劑量 （以存活率計， %） 菌落總數(shù) 突變菌落數(shù) 突變頻率 （突變菌落 /103） 不 純 菌 落（ %） 純 不純 100（對照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 2 27 — 43 30 21 13 誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī) 制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā) DNA 堿基轉(zhuǎn)換或顛換時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，因為缺失是不能回復(fù)的。個別細(xì)胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系 實驗 移接代數(shù) 每代斜面保存時間（天） 回復(fù)子比數(shù) 腺苷產(chǎn)量 （ g/L） 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133， 14 47， 3， 9， 3， 71， 14 47， 3， 9， 3， 13， 58， 14 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 4 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 4， 14， 6， 6， 31 1/ 106 1/ 106 1/ 105 1/ 105 1/ 103 1/ 103 由上表可見，雖菌種總的保存時間都是 147 天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復(fù)突變率也增加，腺 苷產(chǎn)量下降。 其它因素 其它如溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件都會引起菌種的基因突變。 （二）防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯 防止菌種衰退 防止菌種衰退的方法有： （ 1）控制傳代次數(shù) 基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗繁，復(fù) 制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機(jī)會也就越多。一般情況下，斜面每移植一代，霉菌、放線菌、芽孢桿菌在低溫下可保藏半年左右，酵母可保藏 3 個月左右，無芽孢細(xì)菌可保藏 1 個月左右。 （ 2）選擇合適的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件對菌種衰退有一定的影響，選擇一個適合原種生長的條件可以防止菌種衰退。 （ 3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳 代 在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時就會出現(xiàn)衰退和不純的子代。但是這也必須注意到微生物細(xì)胞本身的特點(diǎn)。 （ 4）選擇合適的保藏方法 采用有效的菌種保藏方法也可以防止菌種的衰退。 退化菌種的復(fù)壯 使衰退的菌種重 新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性，稱為復(fù)壯。從而限制退化菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得得以復(fù)壯。但這工作量不亞于新突變株的誘變育種，另外，用遺傳方法選育不易退化的穩(wěn)定菌株或采用雙缺、三缺菌株及減少傳代次數(shù)等方法，都可防止菌種退化，保存穩(wěn)定菌株。它不僅包括了以往 ―發(fā)酵 ‖的全部領(lǐng)域，而且還包括固定化細(xì)胞的反應(yīng)過程、生物法廢水處理過程和細(xì)菌采礦等過程。為此我們必須通過各種研究方法了解有關(guān)生產(chǎn)菌種對環(huán)境條件的要求，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、 pH、氧的需求等，并深入地了解生產(chǎn)菌在合成產(chǎn)物過程中的代謝調(diào)控機(jī)制以及可能的代謝途徑，為設(shè)計合理的生產(chǎn)工藝提供理論基礎(chǔ)。 第一節(jié) 發(fā)酵過程的代謝變化規(guī)律 代謝變化就是反映發(fā)酵過程中菌體的生長，發(fā)酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。 代謝曲線：代謝變化是反映發(fā)酵過程中菌體的生長，發(fā) 酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。 發(fā)酵過程按進(jìn)行過程有三種方式： （ 1）分批發(fā)酵 (Batch fermentation) （ 2）補(bǔ)料分批發(fā)酵 (Fedbatch fermentation) （ 3）連續(xù)發(fā)酵 (Continuous fermentation) 本節(jié)主要介紹分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵三種類型的操作方式下的代謝特征。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 分批發(fā)酵的特點(diǎn) 微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時間而變化，是一個不穩(wěn)定的過程。 不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題 缺點(diǎn)： 非生產(chǎn)時間較長、設(shè)備利用率低。在靜止培養(yǎng)中也可獲得類似的生長曲線。 ①生長延滯期 造成生長延滯的原因有兩種：一是孢子萌發(fā)前的真正的延滯期，另一種是生長已開始但卻無法測量。 ②迅速生長期 此時菌絲體干重迅速增加，其立方根與時間成直線關(guān)系。真菌的生長常表現(xiàn)為菌絲尖端的生長和菌絲的分枝，因此受到鄰近細(xì)胞競爭營養(yǎng)物 質(zhì)的影響。靜止培養(yǎng)時，在迅速生長期的后期的菌膜上格出現(xiàn)孢子。一般是在一短期內(nèi)失重很快，以后不再變化。處于衰退期的菌絲體的細(xì)胞，除頂端較幼細(xì)胞的原生質(zhì)比較稠密均勻 外，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。在高濃度培養(yǎng)基中，可能是因為有毒代謝產(chǎn)物的積累而阻礙生長，如在高濃度碳水化合物的培養(yǎng)基中可積累有機(jī)酸；在含有機(jī)氮高的培養(yǎng)基中可積累氨。在較稀釋的、營養(yǎng)物質(zhì)平衡良好的培養(yǎng)基中，生長停止的主要因素是碳水化合物的耗盡。 分批發(fā)酵的類型 通常有兩種分類方式： （ 1） Gaden39。例如單細(xì)胞蛋白和葡萄糖酸的發(fā)酵。例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。如抗生素發(fā)酵。s fermentation classification （按照產(chǎn)物生成與菌體生長是否同步） ①生長關(guān)聯(lián)型 (第一類型 ) 形成與生長有關(guān)，如酒精、某些酶等。如，抗生素。 7，典型的分批發(fā)酵工藝流程 ）：比生長速率（）物的率（：菌體生長為基準(zhǔn)的產(chǎn)）產(chǎn)物形成比速率（hYQYQggLhgxPPxPP1////:?????? 二、補(bǔ)料分批 發(fā)酵 定義 補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 缺點(diǎn)： 存在一定的非生產(chǎn)時間； 和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險。 連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 能維持低基質(zhì)濃度； 可以提高設(shè)備利用率和單位時間的產(chǎn)量； 便于自動控制。 連續(xù)發(fā)酵 的類型 （ 1）恒化培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度保持恒定 （ 2）恒濁培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定 連續(xù)發(fā)酵的代謝曲線 X：菌體濃度； S：限制性基質(zhì)濃度； t：時間 第二節(jié) 發(fā)酵工藝的控制 工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個最適的環(huán)境，使我們所需要的代謝活動得以最充分的表達(dá)。 （ 2）散熱因素：蒸發(fā)熱和輻射熱。 Q 發(fā) 酵 =Q 生物 +Q 攪拌 Q 蒸發(fā) Q 輻射 （ 1）生物熱： 定義：生物熱是生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動，熱能散發(fā)。一般，菌株對營養(yǎng)物質(zhì)利用的速率越大，培養(yǎng)基成分越豐富，生物熱也就越大。生物熱的大小還與菌體的呼吸強(qiáng)度有對應(yīng)關(guān)系。說 明抗生素合成時微生物的新陳代謝十分旺盛。從此實驗中還可看到，當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時，糖的利用速度也最大。 四環(huán)素生物合成過程中系列參數(shù)的動態(tài)變化過程 1：效價； 2：呼吸強(qiáng)度； 3：生物熱； 4：糖濃度 （ 2）攪拌熱 定義：通風(fēng)發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機(jī)械運(yùn)動造成液體之間，液體與設(shè)備之間的摩 擦而產(chǎn)生的熱 。空氣進(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換。 蒸發(fā)熱的計算： Q 蒸發(fā) =G（ I2I1） 式中 G：空氣流量，按干重計算， kg/h I1 、 I2 ：進(jìn)出發(fā)酵 罐的空氣的熱焓量， J/kg（干空氣） （ 4）輻射熱 定義：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。 3，發(fā)酵熱的測定 （ 1）通過測定一定時間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水進(jìn)出口溫度，由下式求得這段時間內(nèi)的發(fā)